1.6　降低酶糖化过程成本的策略

1.6.1　提高纤维素酶的产量

纤维素生物利用商业化的主要障碍是纤维素酶的水解效率低、用量大，酶制备的成本高，导致纤维素酶糖化过程的成本较高。各国科学研究者通过优化产酶条件、选育高酶活的纤维素酶生产菌株及通过基因工程和蛋白质工程对酶蛋白分子进行改造等来提高纤维素酶的产量。利用物理、化学诱变剂单独或复合处理微生物孢子或细胞是选育纤维素酶高产菌种的有效方法。纤维素酶产生菌一般有细胞生长和酶分泌两个阶段，通过优化菌龄、接种量、pH和温度等因素，在分批发酵和分批补料发酵中实现第一阶段菌物的大量生长和第二阶段酶的最大合成。在纤维素酶的成本中培养基和碳源占很大的部分，这样研究廉价的碳源和高效的培养基是非常必要的。可溶性碳水化合物，如乳糖、木糖和纤维二糖因为可以导致细胞的快速生长和诱导纤维素酶的分泌被广泛研究，但高昂的价格是其工业化利用的障碍。木质纤维素价格低廉，可以被大量利用。纤维素是很好的碳源和诱导物，但只有把纤维素降解成单糖才可以被吸收利用而使菌种生长速度放慢。通过在纤维素中加入可溶性碳水化合物可以提高菌物的生长。优化木质纤维素的预处理技术，使预处理后的原料可以较容易地被菌种利用。培养基中的氮源、磷、镁、钙和微量元素对于纤维素酶合成的影响也很大。

基因工程技术的局限性在于无法实现菌株纤维素酶的全部表达，所得酶不能彻底降解纤维素。由于缺乏纤维素结合域，基因工程纤维素酶不能水解结晶状态的纤维素。另外，基因工程纤维素酶也不能克服木质素、木聚糖的障碍。因此，利用基因工程技术生产有效降解纤维素的纤维素酶还需要做大量的研究工作。

1.6.2　改进纤维素酶的特异活性

纤维素酶的特异活性可通过增加纤维素酶的耐热性、减少纤维素酶的非特异吸附、降低终产物抑制和优化纤维素酶各组分的比例来实现。纤维素酶的耐热温度增加10℃，将导致酶解得率增加2～3倍[109]。纤维素是固体物质，酶首先要吸附到纤维素分子上才能对它进行作用。非特异吸附是指酶水解过程中，纤维素酶吸附在木质素或纤维二糖上，使酶解得率下降。减少非特异吸附可从改进纤维素酶分子的疏水性和通过基因工程构建弱的木质素吸附酶上着手，以减少酶解过程中纤维素酶与木质素的非特异性吸附。改善和平衡纤维素酶中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的比例，可以更有效和最大化降解纤维素成葡萄糖。

木质纤维生物质原料的高效酶水解不仅需要高活力的酶产品，同时还需要配比合理的酶系组成，研究各酶组分的功能和优化酶系组成可以显著地提高酶解得率和效率。Zhou[110]通过响应面分析方法优化了纤维素酶的组分，构建了一个新的纤维素酶体系（Cel7A 19.8%，Cel6A 37.5%，Cel6B 4.7%，Cel7B 17.7%，Cel12A 15.2%，Cel61A 2.3%和β-葡萄糖苷酶2.8%），此新酶体系对蒸汽爆破玉米秸秆显示了高的水解得率，且葡萄糖转化率是原酶制剂的2.1倍。Jing[111]构建的新纤维素酶体系，当滤纸酶活∶内切葡聚糖酶酶活∶纤维裂解酶酶活∶β-葡萄糖苷酶酶活∶果胶酶酶活为0.6∶1∶0.3∶1∶2.6时，水解豌豆杆的得率提高了10.90%。木霉纤维素酶存在β-葡萄糖苷酶先天不足的特点，最简单的解决方法是适当的添加一定数量的β-葡萄糖苷酶。

1.6.3　酶糖化促进剂

在酶水解过程中加入糖化促进剂（如表面活性剂、蛋白质和氨基酸），能极大地提高水解效率，酶解促进剂能够阻断纤维素酶与木质素的不可逆吸附[112～114]。在蒸汽爆破云杉酶糖化过程中加入聚乙二醇（PEG），水解16h，酶解得率从42%提高到78%；且Cel7A的吸附从81%降低至59%；木质素中的疏水基团与PEG中的—CH2—发生作用，苯环上的氢与PEG中的O形成氢键，使木质素对PEG的亲和性高于纤维素酶，且由于PEG吸附在木质素上，PEG的长链结构从木质素表面伸出，阻止了酶的靠近[113]。Zheng[114]研究了Tween-20、Tween-80和牛血清蛋白（BSA）的添加对纤维素酶水解稀酸处理的黑麦草的影响。结果表明每克绝干底物添加0.1g的Tween-20，酶解得率提高了14%。添加酶促进剂增加水解效率的主要原因为外源蛋白或者表面活性剂首先与木质素结合，从而减少木质素与纤维素酶的无效吸附；而对于表面阳离子聚电解质，主要是通过电荷补丁或桥接的作用，增加内、外切葡聚糖酶在纤维素表面的吸附量，进而提高酶水解效率。但是，这些外源蛋白价格昂贵，增加了酶水解工艺过程的总成本，并且部分表面活性剂在搅拌的情况下容易起泡，给实验操作带来不便。

金属离子（K＋，Mg2＋，Ca2＋，Al3＋，Mn2＋，Fe3＋，Cu2＋和Zn2＋）对酶水解也有不同程度的影响。Mg2＋和Ca2＋与木质素磺酸盐形成一种金属和木质素的配合物，可使木质纤维生物质表面的自由木质素发生沉淀，表面的结合木质素由于与金属离子结合减少了纤维素酶与结合木质素的无效吸附，进而增加可发生有效糖化的纤维素酶的量，从而最终提高木质纤维素酶水解效率。然而，尽管Mg2＋和Ca2＋对酶水解有促进，两者大量使用会对后续乙醇蒸发的结构产生较大影响。因此，金属离子的使用在工艺上的可行性及其对木质纤维生物质酶水解的促进机制还有待进一步研究[115～117]。

1.6.4　有效的预处理方法

由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素自身的晶体结构，使得木质纤维生物质形成了致密的结构，酶制剂很难与纤维素接触，直接影响后续的酶糖化过程。酶解未处理的和经蒸汽爆破（T＝220℃）处理的太阳花杆，酶解得率从18%提高到72%，葡萄糖得率从6.1g/100g底物提高至16.7g/100g底物[118]。先用稀酸浸泡，再用湿爆法（蒸汽爆破和湿氧化结合的一种预处理方法）预处理能源作物－Miscanthus（芒属植物），结果表明稀酸浸泡能除去63.2%的木糖和损失5.2%的葡萄糖，直接酶解稀酸浸泡的Miscanthus，葡萄糖得率为24%～26%；酶解湿爆的Miscanthus，葡萄糖得率为37%；酶解先稀酸浸泡再湿爆的Miscanthus，葡萄糖得率达到63%[119]。主要是由于在稀酸浸泡和湿爆过程中，半纤维素很快解聚，导致纤维原料的孔隙率增大，增加了纤维素酶对底物的可及性。当然这种方法是否适用于将来燃料乙醇的工业化生产，还得进行进一步的经济分析。总之，一个好的预处理方法应该是提高后续的酶解得率、产生尽量少的发酵抑制物和操作费用尽量低。

1.6.5　同步糖化发酵

在纤维素酶解的同时加入酵母，不断的移走终产物对酶解的影响，乙醇得率将增加4倍左右。该法的主要优点有：①首先在纤维素酶的作用下，释放的葡萄糖由微生物将其转化为乙醇，消除了葡萄糖因浓度过高对纤维素酶的反馈抑制，提高了糖化效率；②提高水解速度，且酶的用量较小；③得到高的乙醇产量；④简化了设备，降低了能源消耗，节约了总生产的时间。同步糖化发酵法存在的一个主要问题就是糖化和发酵的最适温度不一致。一般来说，糖化的最适温度高于50℃，而发酵的理想温度低于40℃。为了解决这一矛盾，研究者们提出了非等温同步糖化发酵法。但也有研究表明，非等温同步糖化发酵法并不能提高乙醇产率。另外，选育耐热酵母菌也是解决此矛盾的一条途径。

1.6.6　纤维素酶的回收利用

酶水解结束后，纤维素酶存在于水解上清液和酶解残渣中。上清液中的纤维素酶称为游离酶，酶解残渣中的纤维素酶称为结合酶。早期的研究工作已经表明里氏木霉纤维素酶稳定性好，对纤维素有高的亲和力，故在木质纤维生物质的转化过程中回收纤维素酶是可行的[120]。自由酶可以再吸附到新鲜底物上，结合酶脱附后也可重新吸附到新鲜底物上。自由酶的回收可以通过超滤和补加新鲜底物的方法。通过调节pH值和添加表面活性剂使纤维素酶从底物上脱附，是回收结合酶的方法之一。纤维素酶的回收的首要难题是β-葡萄糖苷酶的回收。β-葡萄糖苷酶相对分子量为70～114kDa，作用底物为纤维二糖和纤维低聚糖，不吸附于纤维素底物，酶解过程中始终游离在上清液中。它不吸附的原因之一为酶蛋白上没有纤维素的结合域（CBD），如果有CBD的存在，则对纤维素酶各组分的回收就可实现一步法，即酶解结束后补加新鲜底物让纤维素酶重新吸附的方法同时回收纤维素酶的各组分。Ong把CBD基因转入β-葡萄糖苷酶中取得了成功，且证明拥有CBD基因的β-葡萄糖苷酶对纤维素有很高的亲和力[121]。

尽管各国科学研究者对纤维素酶的回收技术已取得很多进展，但这些技术还是很难应用于工业。主要是因为酶水解结束后，大约有60%的纤维素酶吸附在底物（木质素和纤维素）上，这些酶的回收主要通过添加新鲜底物的方法。但是随着纤维素酶的循环使用，木质素也在不断的累积。木质素含量的增加又会吸附大量新鲜的纤维素酶，从而又影响水解得率。对上清液中的酶，超滤回收纤维素酶和β-葡萄糖苷酶无疑是一种值得研究的技术。但是超滤膜费用昂贵，生产1加仑（1加仑＝3.785L）乙醇超滤膜的费用大约为12美分[122]，并且使用几轮之后，纤维素酶蛋白和木质素对膜的损害较大。