1.4　纤维素酶

自1906年Serlliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶之后，人们对纤维素酶的组成性质、作用方式、分离提纯、测定方法、固定化和工业应用等作了大量的研究工作，其中以纤维素转化为葡萄糖作为主要目标。但纤维素酶及其作用的底物非常复杂，影响因素繁多，糖化速度缓慢，酶的利用率低，酶解效率不高，所以实际应用还存在许多困难。

1.4.1　纤维素酶的来源

纤维素酶的来源广泛，在一定条件下真菌、细菌和放线菌等都能产生纤维素酶，一些原生动物、软体动物、昆虫和植物的组织也可分泌纤维素酶。不同微生物产生的纤维素酶的各组分比例有显著差异，且降解纤维素的能力也各不相同。其中，放线菌耐受高温和酸碱，但由于生长繁殖慢，且纤维素酶的产量低，研究较少。细菌的纤维素酶产量不高，且以内切酶为主，大多数酶对结晶纤维素没有活性，主要为中性和碱性纤维素酶，这种纤维素酶在纺织工业和洗涤剂工业中有着广泛的应用前景和经济价值，并且很多细菌能够产耐热纤维素酶，具有很大的研究价值，目前的研究主要集中在纤维黏菌属、生孢纤维黏菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属。真菌的纤维素酶产量较高，研究最广泛的是木霉属（trichoderma）、曲霉属（aspergillus）和青霉属（penicillium）的菌株，多为丝状真菌，其中木霉属分泌的纤维素酶成分最全、酶活最高，如里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等是目前公认的生产菌种，研究得最多而又最有工业应用价值的是真菌中木霉属的里氏木霉。野生型的里氏木霉合成的纤维素酶酶活低，自20世纪60年代以来，以获得能够产生高酶活的纤维素酶生产菌株为目的，对里氏木霉菌株进行了一系列的诱变育种工作，获得了一些性能优良的菌株，主要包括QM9414、Rut C30和MCG77。其中诱变菌株T.Reesei Rut C30具有较好的抗“代谢物阻遏”的能力。

除此之外，动物体内也存在内源性纤维素酶，已在线虫、白蚁、甲虫、福寿螺等动物体内发现了内源性纤维素酶，并且动物来源的纤维素酶在很多方面显示出与真菌、细菌纤维素酶不同的特性，如从福寿螺胃液中分离纯化得到一种分子量为41.5kDa的内源性纤维素酶EGX，它是一种多功能纤维素酶，能够水解对-硝基苯酚纤维二糖苷、微晶纤维素、羧甲基纤维素、桦木中的可溶性木聚糖以及燕麦木聚糖等底物，是一种具有外切（β-1，4）葡聚糖酶、内切（β-1，4）葡聚糖酶和内切（β-1，4）木聚糖酶三种酶活性的多功能纤维素酶[36]。不同来源纤维素酶所具有的不同特点为纤维素酶的改性创造了良好的条件。

1.4.2　纤维素酶的组成和结构

纤维素酶是一种对纤维素大分子的降解具有特殊催化作用的活性蛋白质，分子量在50000～150000，是降解纤维素成为葡萄糖单体所需要的一组酶的总称，属于含多组分的复合酶系，其中的三种主要组分为内切型（β-1，4）葡聚糖酶、外切型（β-1，4）葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，而每一种组分又由若干亚组分组成，在降解天然纤维素时必须依靠这三种组分协同作用才能将其彻底降解成葡萄糖[37，38]。

内切葡聚糖酶系统命名为1，4-β-D葡聚糖水解酶（EC3.2.1.4），也称内切纤维素酶或Cx酶。它以随机形式水解β-1，4-葡聚糖，作用于较长的纤维素链，对纤维素末端的敏感性比中间键小，主要产物为纤维糊精。外切葡聚糖酶系统命名为1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（EC 3.2.1.91），也称为纤维二糖水解酶（CBH）、外切纤维素酶和C1酶。CBH能从纤维素链的非还原端或还原端一个一个地依次切下纤维二糖单位。单独作用于天然结晶纤维素时酶活比较低，但能在内切葡聚糖酶的协同作用下，彻底降解结晶纤维素。β-葡萄糖苷酶也称纤维二糖酶（EC 3.2.1.21），它能水解纤维二糖和短链的纤维低聚糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加，水解速度下降。这种酶的专一性比较差，它能作用于所有的葡萄糖β-二聚物，包括水杨苷、对硝基苯葡萄糖苷等葡萄糖的芳香基衍生物[37～39]。

大多数纤维素酶分子都由一个或多个催化结构域（CD）和纤维素结合区（CBD）组成，中间由一段可辨认的连接肽连接，只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域。CBD可以使参与纤维素降解的各种酶高效地吸附于纤维素上，使其与各自的底物更加接近，待纤维素被纤维素酶降解到一定程度时，各个酶就可以立刻有效地作用于各自底物。CBD在结晶纤维素的水解过程中扮演着极为重要的角色，当缺失结合域时，外切纤维素酶对结晶纤维素的反应效率明显降低，这主要由于纤维素酶结合域不仅能够增加纤维素表面有效酶的浓度，也能够将表面的单个纤维素分子链解离出来，从而提高纤维素酶的反应活性。催化域和结合域是酶的主要结构部分，分别与酶的催化和酶与纤维素分子的结合有关；连接部位则连接催化域和结合域，使催化性能不受结合域的限制。由于连接部位的存在，结合域与纤维素结合后，催化域仍能够以被固定在纤维素上的结合域为中心摆动，从而与邻近的纤维素分子上的β-糖苷键结合并发生反应[37]。

1.4.3　里氏木霉纤维素酶

理想的纤维素酶生产菌株必须具备在温和预处理条件下能够产生分解纤维素的、活力高、酶系结构合理的纤维素酶；在产酶温度下菌种的生理特性稳定，菌种具有抗抑制物和抗剪切的能力。里氏木霉生产纤维素酶的特点：①里氏木霉生产纤维素酶产量高，而且可以通过物理或化学诱变获取高产菌株；②里氏木霉容易培养和控制，生长环境粗放，适应性较强，容易控制；③里氏木霉产纤维素酶的稳定性好，在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化；④里氏木霉产生的纤维素酶容易分离纯化，其产生的纤维素酶是胞外酶，反应完成后，纤维素酶容易与菌体分离纯化得到所需的酶；⑤里氏木霉及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对纤维素酶的生产造成不良影响。

里氏木霉生产的纤维素酶系各组分结构较为合理，包括两个外切酶（CBHⅠ和CBHⅡ，20%～36%），五个内切酶（EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ、EGⅤ，60%～80%）和两种β-葡萄糖苷酶（β-GⅠ和β-GⅡ，1%）[38]。CBHⅠ的三维结构表明它包含由四个表面环所构成的一个长50Å（1Å＝10－10m）的隧道，CBHⅡ具有一个由两个表面环所构成的长20Å的隧道。EGⅠ中不含有隧道结构，只有凹槽结构，EGⅢ也有类似的结构[39]。里氏木霉纤维素酶的外切葡聚糖酶分子量一般在59～68kDa左右，等电点3.5～4.2；CBHⅡ对其他相关酶组分的表达调控具有关键的作用，分子量50～58kDa，等电点5.1～6.3。内切葡聚糖酶分子量20～55kDa，等电点3.8～7.5，其中EGⅠ表达分泌量约占其产生的胞外蛋白质总量的10%。一般β-葡萄糖苷酶的分子量70～114kDa，等电点4.5～8.7[40～44]。因此，里氏木霉能够分泌完全的纤维素酶系，被公认为是目前最具有工业应用价值的纤维素酶生产菌株。

1.4.4　纤维素酶的合成

酶的生产和合成离不开高产的菌种、合适的碳源及发酵条件，因此降低纤维素酶生产成本的研究主要集中在筛选高产菌种、寻找廉价碳源及优化发酵条件上。

（1）纤维素酶生产菌株的筛选及诱变

从自然界直接筛选得到的野生菌株其产酶能力一般较弱，野生菌种需通过诱变育种提高纤维素酶酶活及产量，如T.Reesei RUT C30是从野生型T.Reesei QM 6A经过一系列诱变得到的纤维素酶高产菌株。目前常采用的诱变方法主要有紫外光、γ射线、EMS（甲基磺酸乙酯）、硫酸二乙酯和亚硝基胍（NTG）等。采用紫外光、硫酸二乙酯和亚硝基胍三种诱变方法对绿色木霉TV-96进行诱变以提高其产酶能力，紫外光、硫酸二乙酯和亚硝基胍的最佳诱变时间分别为：120s、35min和2.5min；在得到的31株突变株中有22株的产酶能力比原始菌株（出发菌株）高，其中突变菌株NTG8的产酶能力最高值为437μg/mL·min，是原始菌株的2.03倍，并具有较好的遗传稳定性[45]。P.Janthinellum NCIM 1171经EMS处理24h及紫外照射3min后，得到一株能够利用结晶纤维素的突变株[46]。T.Citrinoviride经EMS诱变后得到一株诱变株，其滤纸酶活、内切葡聚糖酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和纤维二糖酶酶活分别比原始菌株提高了2.14倍、2.10倍、4.09倍和1.73倍[47]。这些诱变方法可以单独使用，也可以复合使用。T.Atroviride为一株经过NTG（亚硝基胍）和紫外多重诱变得到的突变株，它具有产β-葡萄糖苷酶酶活高的特点。当以汽爆柳树为碳源，T.Atroviride的突变株TUB F-1724所产β-葡萄糖苷酶的酶活为11.70IU/mL，是相同条件下T.Reesei RUT C30所产β-葡萄糖苷酶酶活的167倍[48]。

除了传统的物理化学诱变，原生质体融合也广泛地应用于菌种改造中。原生质体融合是指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合及核融合并形成杂种细胞的现象，也称为细胞杂交。该技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目标产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物。T.Reesei Strain PTr2进行株间融合，得到的融合株，其CMC酶活是原始菌株的两倍[49]。也可将原生质融合技术应用到不同纤维素酶生产菌之间，以获得酶系全面的高产菌株，如将T.Reesei QM 6A与P.Echinulatum融合得到的一株融合株进行液体培养，其滤纸酶活达到2FPIU/mL[50]。虽然原生质体融合育种的研究逐渐增多，但到目前为止，还未获得具有应用价值的、遗传稳定的融合株。

近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究，以期构建高效表达纤维素酶的菌株，其中对里氏木霉基因研究比较透彻。已克隆了CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ，EGⅣ、EGⅤ、BGⅠ、BGⅡ等纤维素酶基因，在E.Coli中得到了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列[51～53]。但纤维素酶在大肠杆菌中的分泌表达水平很低，而且提取很困难。近年来，工业上用一些生长速度快、不产毒素、易于培养、能将产物直接分泌到胞外的木霉或酵母作为表达异源蛋白的理想宿主系统。如在酿酒酵母中分别表达了4种真菌来源的外切酶[54]，这4种外切酶在酿酒酵母中都能够得到表达，且能够降解磷酸润胀纤维素和细菌微晶纤维素，但相对于内切酶和β-葡萄糖苷酶，其表达水平低。此外，外切酶在酵母中表达有一个翻译后修饰的过程，在此过程中外切酶重建二硫键、糖基化，但高度糖基化的外切酶对结晶纤维素的亲和力比天然酶低。肖志壮等将T.Reesei内切葡聚糖酶Ⅲ基因在酿酒酵母中成功得到分泌型表达，并发现其mRNA 5′端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列；又将T.Reesei的外切葡聚糖纤维二糖水解酶CBHⅠ基因和EGⅠ构建到酿酒酵母中，得到的重组酵母能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达，但酶活不高[55，56]。刘北东等以绿色木霉AS3.3711为研究对象，也先后将EGⅠ、EGⅢ和EGⅤ构建到酿酒酵母中，成功获得分泌型表达，但酶活普遍不高，只有0.04～0.06IU/mL[57，58]。将T.Reesei β-葡萄糖苷酶基因BGⅠ、BEⅡ整合到工业酿酒酵母染色体DNA后，转化子能以纤维二糖为碳源生长[59]。

不同微生物所产纤维素酶的酶系有所不同，T.Reesei的纤维素酶是以外切酶和内切酶为主，β-葡萄苷酶的含量较少，而黑曲霉则是重要的产β-葡萄苷酶的菌种，它所分泌的酶中内切和外切酶的含量很少。为了提高纤维素酶的水解效果，可将不同的菌种混合产酶，形成优势互补，改善纤维素酶各组分间的配比。混合菌发酵产酶中对黑曲霉和里氏木霉的混合培养研究较多[60～62]。用黑曲霉PK3和里氏木霉MTCC164按3∶1混合发酵，结果发现内切和外切葡萄糖苷酶酶活提高20%～24%，β-葡萄糖苷酶酶活提高13%[61]。黑曲霉和烟曲霉混合产酶也获得了较好的效果，研究表明这两种霉菌按一定比例接种进行混合发酵时，纤维素酶组分的活性较单菌发酵大幅度提高，滤纸酶、微晶纤维素酶和羧甲基纤维素（CMC）酶酶活分别较单菌发酵提高2.2%～51.1%、20.7%～332.6%、29.4%～299.6%[62]。但混合菌发酵产酶也存在如何协调不同菌种之间的产酶条件，及它们的代谢产物是否会抑制彼此等问题。

细胞的固定化是利用化学和物理的手段将游离的细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性和反复使用的一种技术，它克服了游离的细胞在生产中对环境敏感、性质不稳定及产物难以分离提纯的缺点。固定化细胞的工业化应用与游离细胞相比，可降低产物的生产成本，有利于提高产物的制备效率，实现连续化生产。纤维素酶的生产菌种主要是丝状真菌，用于产酶的底物主要是固体纤维质原料，而一般的固定化材料和方法，如包埋法和交联法会阻碍菌丝体与底物的接触，不适合应用在纤维素酶制备中。夏黎明等[63]采用多孔聚酯材料固定T.Reesei Rut C30菌丝细胞，将固定化细胞在生长限制条件下重复分批培养，让纤维素酶的合成和玉米秸秆的酶解糖化耦合在一个反应器中同时进行。连续重复进行12次分批培养实验，滤纸酶活平均为0.70IU/mL，还原糖26.41g/L，糖化率达到理论值的89.11%。利用固定化里氏木霉产酶，工艺简便、成本低廉，易于连续自动化操作，是一条有效利用可再生纤维素资源的新途径。丝瓜瓤是一种天然多孔高分子材料，但它本身是木质纤维类原料，能被纤维素酶降解，因而并不适合直接用做载体，需通过一定的方法对其改性以增加其对纤维素酶的稳定性。对丝瓜瓤进行乙酰化后，大大增加了其对纤维素酶的稳定性，延长了使用寿命，是一种较好的产纤维素酶菌种的固定化材料[64]。

（2）寻求廉价的纤维素酶生产用底物碳源

纤维素酶的产量和酶活与碳源、氮源、磷、碳氮比、微量元素、pH、溶氧和接种量等多种因素有关[46，65]。凡是可作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。微生物对碳元素的需求最大，细胞干物质中的碳约占50%。碳源物质通过有机体内一系列复杂的化学反应，最终构成细胞物质或为机体提供完成生命活动所需的能量，所以碳源往往也是能源物质。对大多数微生物而言，糖类是最好的碳源。但碳源同时又是酶诱导物的主要来源，碳源的性质和类型直接影响酶的合成和酶活，而且碳源也是影响酶生产成本的重要因素之一。用于纤维素酶合成的碳源包括可溶性物质（乳糖、纤维二糖和木糖等）和不溶性物质（纤维素、半纤维素、乳清、玉米秸秆、蒸汽爆破木材和麦麸等农业废弃物）。对于不溶性碳水化合物，菌种生长和酶分泌的关系目前还不清楚。使用可溶性碳水化合物为碳源可以加快菌株的生长而缩短产酶时间。T.Reesei以13.5g/L的淀粉水解液为碳源，产酶6d，滤纸酶活和纤维二糖酶活分别为2.52IU/mL和0.28IU/mL；在此淀粉水解液中加入1g/L的山梨糖可将滤纸酶活和纤维二糖酶活提高到3.72IU/mL和0.53IU/mL[66，67]。Fang考察了多种碳源诱导A.Cellulolyticus产纤维素酶的能力，发现只有乳糖、纤维二糖和Solka floc纤维素有较好的诱导产酶能力，并且乳糖与Solka floc纤维素混合使用的效果优于两者单独使用[68]。但可溶性碳源相对价格贵，从而导致纤维素酶的成本提高。

用于产酶研究的固体碳源主要是纤维类物质，不同的纤维材料对酶的合成能力不同。P.Echinulatum以滤纸、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、桦木木聚糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素为碳源产纤维素酶，酶活分别为0.27IU/mL、1.53IU/mL、4.68IU/mL、3.16IU/mL、3.29IU/mL、0.1IU/mL[69]。对大多数产纤维素酶的微生物而言，纤维素是最好的碳源，但纯纤维素价格昂贵，不适合大规模工业生产。因此研究者将目光投向农林废弃物、废纸等富含纤维素的生物质原料，以期找到廉价、高效的碳源，这些材料一般不能直接用作碳源，需通过一定的预处理方法使原料结构更适于微生物利用，其中蒸汽爆破生物质的产酶效果较好。但也有研究认为木质素和木质素-高聚糖复合体（LCC）对纤维素酶存在抑制作用[70]。碳源不仅影响纤维素酶的产量而且影响纤维素酶的组成，研究表明里氏木霉使用纤维素或乳糖，其纤维素酶系组成较使用其他的碳源合理。Juhász比较了不同碳源（蒸汽预处理的云杉、柳树、玉米秸秆和脱除木质素的生物质原料）下T.Reesei产的纤维素酶，以玉米秸秆为碳源合成的纤维素酶和内切葡聚糖酶的酶活都比脱除木质素的生物质为碳源合成的纤维素酶酶活高，而使用云杉和柳树培养基的酶活较低[71]。当然，培养基中碳源浓度也很重要的。Xia使用玉米芯为碳源，里氏木霉摇瓶发酵生产纤维素酶，当碳源浓度为40g/L时，纤维素酶酶活达到5.25IU/mL；提高底物浓度，纤维素酶酶活提高，但需要更长的发酵时间，而且纤维素酶生产力（cellulase productivity）下降[72]。白腐菌使用橘皮和柑橘树皮为碳源，橘皮浓度从1%提高到8%，纤维素酶酶活从2.2IU/mL提高到4.2IU/mL；树皮浓度从1%提高到6%，纤维素酶酶活提高95%[73]。

（3）纤维素酶生产的发酵条件优化

纤维素酶的生产主要有液体和固体发酵两种形式。液体发酵适于大规模工业生产，是目前国际上的主要生产方式，但发酵成本较高。固体发酵以农作物秸秆等纤维废弃物为主要原料，工艺简单，成本低廉。

液体发酵中，底物浓度、初始pH、搅拌速度等都对纤维素酶的生产有影响。纤维素酶是一个混合酶系，通过调节pH可以提高酶系中某一组分的产量。研究发现，在T.Reesei中初始pH并不影响最终酶活，但对纤维素酶合成速率和β-葡萄苷酶酶活有较大影响。当控制整个产酶过程的pH为5.0时，纤维素酶合成速率大大提高；pH为6.0，纤维素酶合成速率达到最大，但在产酶后期纤维素酶出现失活现象[74]，pH接近中性有利于β-葡萄苷酶的合成[75]。液体深层发酵过程中，培养基中的溶解氧对于产酶有很重要的影响。产酶过程中，细胞需要分子态的氧作为呼吸链，电子传递系统末端的电子受体与氢离子结合生成水；在呼吸链的电子传递过程中会释放大量的能量，供细胞维持、生长和合成纤维素酶使用。通常可以通过改变通气量或者搅拌速度调节培养基中的溶解氧。Hayward在7L发酵罐中（装液量2.5L）研究气体喷射速度、供氧和搅拌速度对T.Reesei L27产酶的影响。在整个试验过程中溶氧保持在20%以上饱和氧浓度，发现在供氧时将搅拌速度控制在450r/min，喷射速度在0.7～1.4vvm（每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值），或是不供氧时将喷射速度控制在大于2.5vvm时都可将纤维素酶酶活由4FP IU/mL提高到8FP IU/mL（发酵7d）[76]。除此之外，随着发酵罐体积的增大及使用碳源的种类的不同，都会对氧的吸收速率和体积传质系数产生影响[77]。当然，同时控制两个或两个以上的影响因素要比只控制一个影响因素的效果好。如在10L发酵罐中，只控制产酶过程的pH，只能使纤维素酶酶活由1.87FP IU/mL提高到2.79FP IU/mL，但如果同时控制溶氧在20%～30%，可使酶活进一步提高到3.54FP IU/mL，并且使产酶周期由84h缩短到72h，使得纤维素酶的生产能力提高89.3%，生产效率提高120.9%[78]。

与液体深层发酵相比，固体发酵易染杂菌、难扩大生产，但具有工艺简单、成本低廉及产率高的特点。Gao采用A.Terreus M11，以玉米秸秆为碳源固态发酵产纤维素酶，产酶96h，滤纸、内切葡聚糖及β-葡萄苷酶的酶活分别达到243IU/g、581IU/g和128IU/g[79]。通过优化固体发酵过程中的湿度与温度，使T.Reesei RUT C30以麸皮为碳源所产纤维素酶酶活由0.605IU/g提高到3.8IU/g，提高了6.2倍[80]。固体发酵中加入少量的表面活性剂也可以提高酶活。如加入鼠李糖脂在产酶高峰期可以使酶活提高20%～25%，在产酶后期使外切酶酶活和纤维二糖酶酶活提高22.6%和57.6%，且生物表面活性剂的效果优于化学表面活性剂[81]。难以大规模生产一直是制约固体发酵的瓶颈，为了解决这一问题，工业规模的反应器设计成为研究重点。压力脉动固态发酵反应器借鉴了液体深层发酵的无菌操作技术，在管道输送、装盘上实现了严格意义上的无菌操作，且易于工程放大，达到了现代发酵工业的要求，已成功地从实验室的2L、50L、800L放大到25m3、50m3、70m3的工业级生产规模[82]。50L的压力脉动固态发酵反应器中，斜卧青霉在优化条件下（最佳压力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率），以汽爆秸秆为底物，动态培养发酵周期60h比静态发酵周期84h缩短了1/3，酶活为20.36IU/g，比静态酶活（10.82IU/g）提高了1倍[83]。

（4）纤维素酶合成过程的控制

里氏木霉合成纤维素酶包括：①菌丝细胞生长阶段，在这一阶段细胞浓度升高，而纤维素酶不分泌或很少分泌；②酶的合成和分泌阶段，菌丝浓度变化不大，而纤维素酶产量增加。细胞生长和酶的合成阶段需要不同的pH值和温度，细胞的生长最适温度在32～35℃，而酶合成的最适温度在25～28℃；同样在细胞生长阶段最适pH为4.0，而纤维素酶的合成需要的pH为3.0[84]。因此，纤维素酶合成的两个阶段可以指导产酶工艺的优化：在分批培养和补料分批培养的不同阶段需要不同的pH和温度；而连续培养中可以很好地控制酶合成的两个阶段，在第一阶段细胞浓度大量提高，而第二阶段仅用来产纤维素酶。

分批补料培养（FBC），又称半连续培养，是在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。相比于分批培养，FBC具有以下的优点：①可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解产物阻遏；②可以避免在分批发酵中因一次加料过多造成细胞的大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学的性质；③可以作为控制细胞质量的手段，以提高发酵孢子的比例；④可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。而相对连续发酵，FBC不需要严格的无菌条件，生产菌也不会产生老化和变异等问题。在20L反应器中利用纸浆纤维为碳源，分批补料培养，总底物浓度为232g/L，11d后纤维素酶酶活达到57IU/L[85]。Bahia Amouri[86]采用补料分批培养，第4天和第7天加入纤维素，其第8天的纤维素酶酶活和CMC酶酶活比第4天都提高3倍以上。在分批培养中，菌体浓度、营养物质浓度和产物浓度随培养时间不断变化，当营养物质耗尽或有害代谢产物大量积累时，菌体和产物浓度不再增加，培养过程结束。为了解决分批培养的不足，连续培养技术被开发出来，其具有以下优点：①减少开始和结束导致的停工时间；②发酵稳态下容易控制；③产品质量稳定。而分批发酵可以减少菌种的退化危险，同时发酵过程中杂菌污染概率低。在连续培养中，不断向反应器中加入培养基，同时从反应器中不断取出培养液，培养过程可以长期进行，并且往往可以达到稳定状态。

1.4.5　纤维素酶的应用

纤维素酶水解纤维素具有条件温和、催化效率高、专一性强、设备要求简单，且绿色环保等特点，随着研究的不断深入，以及不同特性纤维素酶的发现，现已广泛用于食品、造纸、纺织、饲料、生物能源等领域。

在酿造行业，采用固体发酵工艺生产白酒过程中添加纤维素酶，可同时将原料中的淀粉和纤维素转化为糖，再经酵母发酵转化为乙醇，使乙醇得率提高3%～5%，酒体质量纯正。在酱油酿造中添加纤维素酶，可使大豆类等原料的细胞膜膨胀软化破坏，使包藏在细胞中的蛋白质、糖类物质释放，从而缩短酿造时间，提高产率和品质，使氨基酸还原糖含量增加。

在饲料行业，常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的纤维素。纤维素酶是畜牧业中的一种新型饲料添加剂，可以弥补畜禽内源性纤维素酶的不足，提高饲料的利用率，能使畜禽最大限度地利用饲料，降低饲料成本。在纺织工业中，纺织品的天然纤维素纤维结构复杂，结晶度高，利用纤维素酶对纤维素纤维织物进行生物整理后，可使纺织物膨松、柔软、表面光滑，清除毛羽、棉结，织物光泽、色泽和鲜艳度明显改善。

在食品加工行业，大多数果蔬中不同程度地含有纤维素，在加工过程中采用纤维素酶作适当处理，可以使植物组织软化，改善口感，简化工艺。

在洗涤剂工业中，碱性纤维素酶主要是内切葡聚糖酶，可选择性吸附在棉纤维非结晶区，使棉纤维膨松，水合纤维素分解，使纤维上的胶状污垢脱落。

在石油开采中，纤维素酶制剂可以作为石油开采中的破乳剂，具有专一性强、无副作用、对地层和环境无污染的优点。

纤维素酶将来最大的用途是用于纤维素乙醇的开发，自20世纪70年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源——生物乙醇。利用纤维素酶降解木质纤维生物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗；或者利用基因工程把纤维素酶基因克隆到酿酒酵母中，可直接将纤维素转化来生产乙醇。