8.心脏TRPM4通道

一　瞬时受体电位通道

瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel，TRP）最早是在果蝇突变体的视觉系统中发现的，视觉系统对持续的光刺激可产生瞬时而非持续的峰电位。20世纪80年代末，研究人员从果蝇中克隆出原始型TRP蛋白，认识到它是多种分子组成的大家族，这些分子可能形成多种特性还不完全清楚的离子电流。TRP通道家族成员有50种以上，根据氨基酸序列的同源性分成7个亚族：TRPC（canonical）、TRPV（vanilloid）、TRPM（melastatin）、TRPP（polycystin）、TRPML（mucolipin）、TRPA（ankyrin）和TRPN（NO-mechano-potential）。在果蝇中发现的TRP通道家族成员有13个，哺乳动物中有28个。TRP家族的共同特点是它们都有6个跨膜结构域（S1～S6），S5与S6片段之间构成离子通道，这一结构符合许多阳离子通道（如电压依赖性离子通道）的特征，在跨膜亚单位S5和S6之间形成的P环决定其对各种阳离子的选择性。

由于TRP的S4跨膜区域中仅有少量带正电荷的氨基酸，难以形成电压依赖性离子通道感受器，目前认为绝大多数的TRP通道是非选择性阳离子通道，主要介导Ca2+、Na+和K+，而不是过去认为的电压依赖性通道。TRPM4和TRPM5传导Na+和K+能力差别不大，但对二价阳离子（Ca2+）不能通透，除TRPM4和TRPM5外，大多数TRP通道对Ca2+通透。

二　TRPM4通道

（一）概述

人类基因TRPM4是TRP基因家族中的M4亚型。TRPM4通道由1214个氨基酸构成，由人类第19号染色体上的基因编码，分子结构类似于一个电压依赖的钾通道，其核心由4个α亚基组成，包含6个跨膜（TM1～TM6）结构域，S5与S6片段之间构成离子通过的孔道——P环。TM5、TM6和P环共同构成具有选择过滤性的中央传导通路，TRPM4选择性地通过单电荷阳离子，通透性大小顺序是Na+＞K+≥Cs+＞Li+，但对Ca2+不通透。在人类和小鼠，TRPM4基因编码转录成两种类型：TRPM4a和TRPM4b。分子生物学研究证明许多组织中存在TRPM4。在小鼠，TRPM4a和TRPM4b主要表达于大脑、心脏、主动脉、小肠和结肠；在人类，TRPM4a和TRPM4b主要表达于心脏、肾和内皮细胞。在多种造血细胞系中也可观察到TRPM4，包括T、B淋巴细胞系和单核细胞。目前发现，只有小鼠TRPM4a和人类TRPM4b长片段介导离子电流，而短片段的作用还不明确。TRPM4在多种组织中的广泛表达与许多病理生理学过程有关，包括T细胞的调节、胰岛素的分泌、脑动脉中的机械转导以及儿茶酚胺介导的血压调节。

TRPM4对Ca2+的敏感性、脱敏和电压依赖性与其NH2和COOH末端含有的多个位点有关，包括多个PKC磷酸化位点，2个ATP结合体转运子样模序，5个钙调蛋白结合位点，4个Walker B位点（可能为ATP结合位点），1个PIP2结合位点和1个螺旋结构域。其中，C末端钙调蛋白结合位点可显著降低TRPM4的Ca2+敏感性，同时使TRPM4通道的电压依赖性兴奋性偏移到非常正的电位，而N末端钙调蛋白结合位点对TRPM4的Ca2+敏感性无作用。PIP2可调节钙通道的敏感性，从而调控通道的活性。PIP2通过增加Ca2+敏感性使TRPM4通道的电压依赖性兴奋性偏移到非常负的电位，从而加强TRPM4的活性。通过全细胞和内外膜片钳方法研究，证明N末端突变和Walker B模体突变可导致TRPM4更快更完全的失活。当细胞内游离ATP达到10nmol/L时，TRPM4活性被抑制，其他类型腺嘌呤核苷酸也有抑制作用。细胞内Ca2+浓度在0.4～9.80nmol/L时，TRPM4激活，该激活过程通过ATP、钙-钙调蛋白和PKC调节。不同的温度可调节TRPM4的电压敏感性，温度增高引起电流增大。

TRPM4通道可介导Ca2+激活非选择性阳离子通道（NSCCa，Ca2+-activated non-selective cation channels）。随着TRPM4分子结构的发现以及药物化合物的出现，对NSCCa电流生理作用的认识有了极大的提高。研究表明，TRPM4可调节体内多种生理过程。细胞对TRPM4激活或失活的反应取决于细胞类型和膜离子转运体的表达幅度。膜电位为负值时，TRPM4通道使Na+进入细胞，导致细胞膜去极化。膜电位为正值时，TRPM4通道可能使K+进入细胞，导致膜复极化。由于细胞内Ca2+参与多个生理过程，且Ca2+内流与许多因素有关。因此认为，TRPM4通过改变细胞膜电位参与感受细胞内Ca2+，影响Ca2+及其他离子的驱动力。研究表明，TRPM4可影响非电压依赖性钙通道（NVDCC）和电压依赖性钙通道（VGCC）。TRPM4在Ca2+驱动力中的电位作用对T细胞和HL1小鼠心肌细胞内Ca2+波动频率有重要的影响，抑制这些细胞中的TRPM4通道能避免Ca2+浓度波动，使细胞内Ca2+浓度具有时相性。TRPM4可以将细胞内钙离子浓度的变化转变为电压幅度的变化，从而调节包括钙等离子进入细胞内的驱动力。通过调节钙离子，TRPM4可进一步调控淋巴细胞分泌细胞因子和胰岛β细胞分泌胰岛素。TRPM4还可增强神经兴奋性，促进控制呼吸的pre-Bötzinger复合体节律的形成。此外，遗传性TRPM4突变可引起心脏传导功能的异常，引起进行性传导系统疾病，在某些病理情况下，细胞内Ca2+浓度升高时内向电流的增大可诱发快速性心律失常。

NSCCa电流也有可能成为药物作用的靶点，药理研究中使用最普遍的阻滞剂是氟芬那酸，它可以抑制TRPM4和TRPM5；精胺也可抑制这两种通道；磺酰脲类药物格列本脲可抑制TRPM4。但是这些化合物均缺乏选择性，因为其也可同时抑制其他离子通道。近来新发现了两种可调节TRPM4的物质，免疫抑制剂吡唑衍生物BTP2可活化TRPM4，9-菲酚衍生物可抑制TRPM4，对TRPM5无作用。TRPM5与TRPM4大约有50%的氨基酸序列具有同源性，因此具有相同的生理特性，如单通道传导性、离子选择性和对电压、钙、PIP2及温度的敏感性，但是TRPM5不能被细胞内ATP抑制，它主要表达于味觉感受器细胞和消化系统。

（二）心脏中的TRPM4

1.概述

TRPM4在心血管系统中大量表达，如心脏传导组织、心房肌及静脉平滑肌细胞，参与调节心脏节律，包括心脏传导功能、起搏和动作电位的复极过程。这些作用使TRPM4通道可能成为治疗心脏疾病的新型靶向。

在一名先天性心功能异常的患者证实了TRPM4突变，该患者染色体第7位点的谷氨酰胺被赖氨酸替代，引起心脏束支传导阻滞进行性加重。这是首次发现人类TRPM4突变与其通道引起的病理状态相关。通过异源表达TRPM4发现TRPM4突变并不能改变离子通道的生理学特性，但是可以改变突变蛋白的泛素化，从而导致细胞膜蛋白表达增高以及电流的增加。然而，通道功能的增强和心脏传导阻滞之间的联系仍不明确。通过降低膜电位，TRPM4可能改变电压依赖性钠通道的开放，引起心脏传导组织功能异常。

TRPM4电流存在于窦房结细胞和心房肌细胞，而在心室肌细胞中表达较低。当心室肌肥大时，TRPM4在心室中表达增高。在自发性高血压（SHR）大鼠造成的心室肥大及室性心律失常的心室肌细胞中存在TRPM4的过度表达。TRPM4通道可能引起心肌Ca2+激活瞬时内向电流Iti，Iti最早在小鼠心肌细胞发现，在肥大的心室中可形成延迟后除极及心律失常。

TRPM4基因的显性遗传突变与心脏传导紊乱——进行性家族性心脏传导阻滞Ⅰ型、孤立性心脏传导疾病导致的传导阻滞、右束支阻滞、心动过速和Brugada综合征等相关。文献报道目前已发现10种TRPM4的基因突变体与心脏传导疾病相关，表明该通道是人类心脏传导疾病的重要易感基因。TRPM4基因突变体相关的表型与编码电压门控钠通道Nav1.5的SCN5A突变体相似，表明这两种心脏通道可能存在相互影响，参与心脏细胞兴奋性的形成和冲动的传播。

2.TRPM4在窦房结中的作用

小鼠的窦房结细胞中同样有TRPM4表达。研究者发现在小鼠窦房结起搏细胞中存在非选择性阳离子通道单电流。通过研究该单通道电流的生物学特性，如传导性和离子选择性，以及对于TRPM4弱抑制剂氟芬那酸的敏感性，结果发现TRPM4通道介导了这种电流的形成。然而，宏观的NSCCa电流还未在窦房结和其他结细胞中检测到。上述发现表明TRPM4可能参与了起搏细胞的自律性活动，在心脏节律的产生和调节中发挥了关键作用，TRPM4可能成为控制心脏节律的又一新的治疗靶点。

3.TRPM4在心室肌细胞中的作用

多个研究发现心室肌细胞中存在罕见而小量的类似TRPM4的电流，尽管在这些细胞中几乎没有发现TRPM4 mRNA的表达。Guinamard等发现，相比正常血压的WKY大鼠，SHR大鼠心脏TRPM4的mRNA水平有显著升高，表明TRPM4介导的电流可能参与肥大心肌细胞的致心律失常电重构。这个发现可能解释SHR大鼠心肌细胞中延迟后除极频率增高的现象。尽管TRPM4通道在伴有心肌肥大的心律失常的发生中发挥重要作用，但TRPM4在心室肌细胞中的具体作用还不完全明确。

4.TRPM4电流和Iti电流在心室肌细胞中的作用

心律失常可能由触发活动或传导异常诱发。触发性心律失常是指提前出现的自动去极化引起的动作电位所触发的心律失常事件。与传导改变相关的心律失常主要源自冲动传导的延迟或阻断，或源自单向传导阻滞。一项研究发现Ca2+可激活非选择性阳离子通道，有很强的电压依赖性，介导心室肌细胞的瞬时内向电流Iti，而且心肌肥厚导致的Ca2+超载中也出现Iti电流。Iti形成的分子机制尚存在争议，但是多个研究均表明该电流是由Ca2+诱发的，而且与延迟后除极的形成有关。这些特性支持Iti由TRPM4介导或调控的假说。

5.TRPM4在心脏传导系统中的作用

研究发现，TRPM4染色阳性见于心房肌细胞和浦肯野纤维，而很少见于希氏束和心室肌细胞，该发现与TRPM4突变的患者心脏传导减慢的结论一致，也与TRPM4基因敲除小鼠的表型一致。在心肌细胞兴奋性中，TRPM4通道可能主要介导Na+内向电流。通过对人心脏组织中TRPM4的mRNA的表达的评估，发现TRPM4在浦肯野纤维中大量表达，而在左室中表达很少。表达量多少的相对顺序是浦肯野纤维≥室间隔、右室＞右房、左室。有趣的是，TRPM4在小鼠与人组织中的表达不同，在小鼠大量表达于心房。对牛的冻存心脏组织进行免疫组化染色检测TRPM4的表达，发现浦肯野纤维高表达，而心房和心室组织中表达相对低。TRPM4在人类浦肯野纤维的高表达，以及ICCD和PFHBI表型，表明TRPM4在人类心脏传导系统发挥重要作用。但是TRPM4导致传导阻滞的潜在分子机制还不明确。携带PFHBI和ICCD突变的TRPM4通道表现出显性的功能获得表型。显然，这与生物特性的变化无关，而是与TRPM4电流密度增加有关。研究表明与ICCD和PFHBI突变相关的TRPM4电流增加导致膜传导阻滞增加，使动作电位不能下传至浦肯野纤维。该假说与患者心电图宽QRS波形的发生一致，而且可以解释所观察到的右束支阻滞、双束支阻滞以及心室内传导阻滞。TRPM4通道的Ca2+活性EC50值约1µmol/L。近来的研究证明，TRPM4通道更可能由心脏动作电位后时相细胞内Ca2+升高而激活，从而抑制动作电位复极化。另外，功能获得和功能缺失突变可能通过减少Nav1.5通道导致传导减慢。然而，另一种可能性是TRPM4通道通过与超常传导相似的机制影响传导速度。超常传导是观测到的细胞外液K+浓度决定膜电压的最佳值。K+浓度升高或降低均会降低心脏传导速度。因此认为，TRPM4的功能获得和功能缺失突变可能导致细胞外液K+浓度升高或降低，继而影响心脏传导速度。另一项研究发现，HL1小鼠心肌细胞中TRPM4的活性影响细胞内Ca2+浓度的变化，但是对于心脏传导的重要性还需进一步研究。

6.TRPM4基因敲除小鼠的研究

对转基因小鼠的研究表明，与野生型相比TRPM4-/-小鼠的血压升高。基因敲除型与野生型小鼠在血管收缩力、肾排Na+和K+、血清Na+和K+浓度、血细胞比容或血浆容量等各项指标中无明显差异。另外，在肾素-血管紧张素-醛固酮系统的调节或血管肌源性反应方面也未观测到不同。动脉血压部分由神经激素控制，通过测量TRPM4蛋白在神经系统中的表达，可以研究神经源性机制在高血压发展中的作用。乙酰胆碱刺激后，TRMP4-/-小鼠嗜铬细胞的胞吐事件数量增加，表明这种高血压的发生是由神经内分泌失调引起的。关于TRPM4-/-小鼠的心脏电生理研究发现，相比TRPM4+/+小鼠，KO小鼠的PR 和QRS间期延长，而且心脏传导系统的希氏束上方和下方传导时间均降低。TRPM4-/-小鼠表现出更频繁的房室传导阻滞，表明TRPM4在心脏传导系统中起着重要作用。

对TRPM4-/-基因型小鼠的研究证明TRPM4在小鼠心脏兴奋性的调节中发挥重要作用。TRPM4-/-小鼠表现出包括PR和QRS间期延长的心律失常，房室传导阻滞的发生也比野生型对照组更频繁。TRPM4基因敲除小鼠与TRPM4的抑制剂9-phenanthrol都促进了TRPM4在心肌细胞中的功能研究。与同窝对照组小鼠相比，TRPM4-/-小鼠分离的心房肌细胞的动作电位时程缩短了20%。而且，9-phenanthrol降低野生型对照组的心房动作电位时程，而不降低TRPM4-/-小鼠的动作电位时程，表明TRPM4在心房中具有调节动作电位时程的作用。因此，在病理情况下，TRPM4的激活可能延长动作电位时程，从而导致早后除极的发生，成为房颤的潜在触发点。另一方面，对于窦房结的起搏活性，TRPM4与超极化的激活核苷酸敏感（HCN）通道以及Na+/Ca2+交换体（NCX）发挥重要的协同作用。

9-phenanthrol的应用显著降低了自发性搏动的小鼠和大鼠右房的心率。该抑制剂的作用是频率依赖性的，在心率慢时作用更明显。TRPM4-/-小鼠心房对9-phenanthrol不敏感。9-phenanthrol使舒张期去极化斜率降低，表明TRPM4在预防心动过缓中起重要作用。临床观察到人群中TRPM4基因突变与心动过缓有关，也证明了这一点。在鼠类缺血再灌注诱导早后除极的心脏模型中发现，TRPM4参与早后除极的发生。给予9-phenanthrol可以消除小鼠右室早后除极，且呈剂量依赖性。Vennekens等采用膜片钳、膜电位测量、显微镜荧光测定、收缩试验和活体内压力-容量曲线分析方法研究了TRPM4-/-小鼠的表型。这些试验的结果都显示小鼠活体内心脏TRPM4通道活性与β肾上腺素变力反应的调节有关。由于人类和啮齿类的心脏生理方面存在显著差异，所以，人类心肌细胞中TRPM4通道活性是否也与β肾上腺素变力反应的调节有关，还有待进一步研究。

综上所述，心脏TRPM4通道在心脏节律的调节中起重要作用，而且可能是开发治疗心律失常合并心肌肥厚或急性心衰的新型药物的靶点。目前对其主要的分子和细胞机制有待进一步明确。不清楚的是：TRPM4在心脏传导系统中的具体作用是什么？尤其是在健康人群和患者的心房和窦房结细胞中的作用。为何ICCD基因突变对TRPM4电流密度有显著的功能获得性作用？激活TRPM4通道的Ca2+的来源是什么？TRPM4通道是细胞外Ca2+依赖的还是肌质网释放的Ca2+激活的？这些问题有待进一步研究证明。

（吴林　任璐）

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