第三章 咳嗽动物模型
动物实验对于研究人类疾病的病因、发病机制、病理生理和临床前药物试验等均有极其重要的意义。咳嗽病因多样，机制尚未完全阐明，难治性咳嗽（咳嗽高敏综合征）缺乏十分有效的治疗药物等均是临床亟待解决的难题。复制咳嗽动物模型可以实现对咳嗽反射发生、调控的机制作最基础的研究，为研究慢性咳嗽发病机制提供实验工具，同时为开发新型有效的镇咳药物，如速激肽受体拮抗剂、TRP通路拮抗剂、P2X3受体拮抗剂及中药止咳成分等，提供新的理论基础。
近年来，随着电生理学、分子生物学、脑功能成像技术的发展及在咳嗽基础研究中的应用，人们对咳嗽的机制有了更深入地了解。此外，咳嗽相关的动物模型也得到了扩展。例如，通过声音监测及咳嗽声音波形识别技术，研究人员首次证实了小鼠能够产生咳嗽。除了过敏原（卵清蛋白和OVA）、香烟烟雾、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI类药物）和二氧化硫、氨水刺激等传统方法外，胃食管反流、真菌感染、病毒感染和大气污染（臭氧、PM2.5）等相关的咳嗽模型也有报道。以下将对咳嗽相关模型的动物选择、诱导咳嗽的刺激方法、造模方法、评估手段及模型制备的注意事项等进行阐述。
在肺组织的结构及气管、支气管的神经支配方面，咳嗽模型动物越近似人类越好。目前用于建立咳嗽模型的动物主要有豚鼠、小鼠、兔、猫、狗和猪等。其中狗、猫、猪等大动物实验比较容易操作，缺点是成本高，进行药物筛选研究时需要耗费大量药物，而且难以进行多组、大量研究。因此，大动物不可用于常规筛选，但可用于需要进一步研究药物的三级筛选。啮齿类小型动物，如小鼠、豚鼠等繁殖、生命周期较短且繁殖数量较大，饲养繁殖及药物使用的成本较低，适宜于大批量实验。
豚鼠的咳嗽反射容易被激发，免疫系统发达，容易建立咳嗽模型，是近年来咳嗽反射及咳嗽新药药理研究最常用的动物。咳嗽反射的气道传入神经分类的主要依据亦来源于对豚鼠的相关研究。豚鼠作为咳嗽模型的常用动物具有以下优势：①可在清醒、不限制活动的状态下产生咳嗽。麻醉的动物和人之间咳嗽反应性存在着差异。有报道，豚鼠在麻醉状态下完全保存了机械刺激诱发的咳嗽反射，但辣椒素和缓激肽（C纤维刺激剂）刺激C纤维却无法启动甚至可能抑制咳嗽反射。②豚鼠咳嗽的声音辨识度较高，而且对柠檬酸、辣椒素等化学刺激产生的咳嗽反射与人类十分相似。③体外研究显示，机械刺激豚鼠迷走神经引起的去极化过程与人类相似。在制备豚鼠咳嗽模型时，给予支气管舒张剂，例如β-肾上腺受体激动剂做预处理，可以抑制豚鼠气管过度痉挛而造成窒息，保证实验能顺利完成。
过去通常认为，小鼠的咳嗽反射不敏感，且与人类咳嗽反射差异较大，不是咳嗽模型的理想动物。这种观点主要基于以下两点证据：其一是小鼠缺乏有髓鞘的Aδ纤维快适应牵张感受器（RARs）及上皮内神经末梢；其二是小鼠不能产生咳嗽所需的足够能量。然而，研究人员通过结合小鼠呼吸气流的波形及监测所产生的声音，初步判定出小鼠能产生咳嗽；随后利用止咳药物（可待因）及TRPV1受体拮抗剂（辣椒平）的干预，可以显著抑制辣椒素激发的小鼠咳嗽次数，进一步证实化学刺激能够引起小鼠咳嗽的产生。随后，国内、外多家研究机构通过小鼠呼吸声音及波形的综合判读，均观察到小鼠能够产生咳嗽。小鼠咳嗽模型的建立及推广将为咳嗽机制的研究、止咳新药的研发提供极大便利。
不同种属动物咳嗽反射的形成和调控机制存在差异，对诱发因素和激发方式的反应也不尽相同。应根据研究目的，合理选择实验动物、造模方法和观察指标等。
咳嗽是通过复杂的反射过程完成的，参与此过程的环节包括咳嗽感受器、传入神经、咳嗽中枢、传出神经及效应器官。咳嗽受体被激活后，将传入冲动沿迷走神经传入纤维传至延髓孤束核进行神经元换能，经整合后再传至大脑皮质咳嗽中枢，咳嗽中枢接收的这些信号再经迷走神经传出纤维传至各效应器官，通过调节呼吸肌活动、声门的闭合完成咳嗽反射，排出黏液或异物。由此，接触、压迫、炎症、灰尘和化学气体等都能引起咳嗽反射，应该在制造模型的过程中注意排除上述干扰因素对实验结果产生的影响。
常用的诱导咳嗽的方法有机械刺激法和化学刺激法：
通过有髓鞘的迷走Aδ传入纤维引起咳嗽。例如有人用兔的胡须或聚乙烯管进行机械刺激，可诱导豚鼠气道和喉部咳嗽反射的发生；也有用电刺激引发咳嗽报道。机械刺激法一般只能在麻醉状态下进行。
采用化学物质（咳嗽刺激剂）刺激呼吸系统引发咳嗽，是比较常用的方法。常用的咳嗽刺激剂有辣椒素、柠檬酸、异硫氰酸烯丙酯（AITC）、肉桂醛、二氧化硫和氨水等。辣椒素是通过刺激含神经肽的无髓鞘的化学敏感性C纤维传入神经，其作用的分子靶点为瞬时受体电位香草素1（TRPV1），柠檬酸则除刺激C纤维上的TRPV1受体，也刺激Aδ传入纤维末端。AITC可以特异性激活迷走C纤维上的瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）受体，引起咳嗽的产生。有研究对比TRPA1激动剂及TRPV1激动剂在诱导咳嗽产生中的效力，结果显示TRPA1激动剂AITC（10mmol/L）诱导的C纤维活化及咳嗽次数，要比TRPV1激动剂辣椒素（50μmol/L）弱3倍左右。
刺激剂的给药途径十分重要，同一刺激物，如果采用不同的给药途径，动物所表现出的咳嗽敏感性会有所不同。在动物模型制备过程中，常采取雾化吸入或者局部注射给予刺激剂引发咳嗽。在喉部分布着密度极高的RARs神经纤维，这些神经元可被机械刺激激活。因此，通常认为喉部是诱导咳嗽发生的最理想场所。Tanaka等研究比较雾化吸入柠檬酸（0.05～0.8mol/L）和辣椒素（0.01～0.1mmol/L）之后咳嗽次数的变化，结果显示柠檬酸与辣椒素激发的咳嗽次数均为剂量依赖性，咳嗽次数无明显差别，提示两者引发咳嗽的机制相同（可能通过辣椒素敏感性C纤维）。但若通过喉部局部注射的方式进行咳嗽激发，结果显示辣椒素诱导的豚鼠咳嗽敏感性可被辣椒素预处理所阻断，而柠檬酸诱导的豚鼠咳嗽的次数较刺激前明显增多（吸入0.8mol/L柠檬酸时，咳嗽次数达34.00次±3.77次），且不被辣椒素预处理所阻断。提示吸入柠檬酸后以激活C纤维感受器为主，而局部注射柠檬酸除刺激喉部C纤维外，还刺激其他的传入纤维（可能是Aδ纤维）。
2003年，由Tanaka等首次采用局部注射刺激剂建立咳嗽模型。具体方法：以Hartley雄性豚鼠（300～400g）为例，麻醉后（戊巴比妥钠30mg/kg，腹腔注射），分离气管，将聚乙烯导管（内径0.4mm，长13cm）插入气管至第5～6气管软骨，将导管尖端放置在喉下，距离喉部约10mm处固定（导管缚线固定于第六气管软骨），导管的另一端则从背部皮下引出，予1%亚甲蓝20μl确定导管放置位置的准确性，以备准确注射咳嗽刺激物（图3-1）。管的外端以不锈钢管（直径0.3mm）封闭以防止干燥。长期留置导管时，还需每天用室内空气冲洗导管以防止闭塞。豚鼠清醒后，依据实验设计，可注射0.4mol/L柠檬酸20μl（分10次注射，每次间隔30秒）制备豚鼠咳嗽模型。相比雾化吸入咳嗽刺激剂法制备的咳嗽模型，此模型具有以下优点：①制备过程中，未经鼻进行咳嗽刺激物的激发，豚鼠很少出现打喷嚏的动作，因而有利于咳嗽症状的准确评估；②制备模型时，可以根据实验设计要求，移动聚乙烯导管的前端位置，选择咳嗽刺激物刺激的具体部位；③保证了咳嗽刺激物用量的准确性和可比较性。避免动物因第一次雾化吸入给药时产生的不适而调整呼吸，降低吸入剂量，造成吸入激发物总量的偏差。
正如咳嗽是一种临床症状，而非一种疾病一样，我们这里要介绍的动物咳嗽模型并非一种单纯咳嗽模型，而是包含了与咳嗽有关的不同疾病的动物模型。理想的咳嗽动物模型应该与人类咳嗽的病理生理改变相类似，即无明显的肺部炎症，对外界环境的刺激表现为咳嗽敏感性的增高。人类咳嗽可表现为多种形式，除了受刺激表现出来的反射性咳嗽，主要还是以自主性咳嗽为主，还可以表现为咳嗽冲动（urge to cough）的增强；而豚鼠的咳嗽主要以咳嗽激发物刺激之后表现出的反射性咳嗽为主，还未见动物自主咳嗽及咳嗽冲动的系统报道。
单纯咳嗽模型是指直接通过刺激物刺激而制备的咳嗽模型，此类模型常被用于研究咳嗽反射的发生机制和咳嗽新药的研发等。
常用的咳嗽刺激剂有辣椒素、柠檬酸、AITC、肉桂醛、丙烯醛、前列腺素E2（PGE2）、缓激肽、二氧化硫和氨水等，其中辣椒素和柠檬酸应用最为广泛。常用柠檬酸浓度范围为0.05～0.8mol/L，辣椒素为0.01～10mmol/L。其他咳嗽激发物，如AITC所用浓度范围为0.3～30mmol/L，肉桂醛（10～30mmol/L），丙烯醛（10～100mmol/L），PGE2浓度范围为0.03～0.3mg/ml，缓激肽浓度范围为0.3～10mg/ml。需要注意的是，在开展咳嗽激发实验时，应根据动物的种类、雾化时间长短、所要达到的研究终点进行激动剂类型及浓度的选择，表3-1中列出的浓度范围并非一成不变，建议在开展正式实验之前最好进行咳嗽敏感性筛选的预实验。
这类模型是最为常用的单纯咳嗽模型，具体应用于：
豚鼠咳嗽模型在研究咳嗽外周神经机制中发挥了重要作用。有研究选择重量达800～1000g的支气管高敏（bronchial-hypersensitive，BHS）豚鼠和支气管减敏（bronchial-hyposensitive，BHR）豚鼠，通过雾化吸入柠檬酸（0.3mol/L）10分钟制备咳嗽模型，结果发现BHS豚鼠咳嗽敏感性显著高于BHR豚鼠，其原因与BHS气道咳嗽感受器，尤其是C纤维感受器对咳嗽刺激物的敏感性增高有关，同时也证实气道平滑肌的收缩与咳嗽的发生密切相关。
瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）是近年来研究咳嗽高敏感性机制一类重要靶点。研究人员通过利用豚鼠模型，发现了TRPV1主要分布在豚鼠气管、支气管及肺泡的神经轴突，并可以表达与气道上皮细胞、成纤维细胞等多种结构细胞。通过雾化吸入TRPV1的特异性激动剂辣椒素，能够引起豚鼠咳嗽次数的增多，而TRPV1受体的特异性拮抗剂辣椒平能够显著抑制辣椒素诱导的咳嗽高敏感性，提示了TRPV1是诱导咳嗽产生的一个重要靶点。在此基础上，科学家通过分析人体气道黏膜活检标本，进一步证实气道TRPV1的高表达与咳嗽敏感性的增高存在显著相关关系。此外，通过豚鼠咳嗽模型，研究人员发现TRP家族的另外一个亚型TRPA1亦能够被其特异性激动剂肉桂醛及AITC激活，引起豚鼠咳嗽敏感性增加，且该效应能被TRPA1选择性拮抗剂HC-030031抑制，在此后的人体咳嗽激发试验中也提示肉桂醛能作为咳嗽的激动剂引起人体咳嗽的产生。PGE2及缓激肽作为咳嗽激发剂，亦能够通过TRPV1及TRPA1通路引起豚鼠咳嗽敏感性的增加，提示了PGE2及缓激肽在咳嗽发生中的作用地位。
此外，通过豚鼠咳嗽模型，越来越多的咳嗽相关的外周及中枢靶点得到证实，例如P2X家族受体、钠离子电压门控通道受体和咳嗽中枢相关靶点（NMDA）等。这为人们更深入了解咳嗽的机制及止咳的研发起到重要作用。
Shinagawa等观察THA2合成酶抑制剂对咳嗽的治疗效果时，选择3～4周龄的豚鼠，通过麻醉后暴露于辣椒素（浓度为100μmol/L，颗粒直径大小约5μm）制备咳嗽模型，观察血栓素（THA2）在咳嗽反射中的作用。结果显示THA2样物U-46619本身不引起咳嗽反应，但它使辣椒素刺激诱发的豚鼠咳嗽次数增高两倍以上。如果在辣椒素刺激诱发咳嗽前给予THA2合成酶抑制剂奥扎格雷（ozagrel）口服，则使辣椒素刺激诱发的豚鼠咳嗽次数明显减少。研究表明THA2与辣椒素咳嗽敏感性的调控有关，尽管THA2本身不能诱发咳嗽，但可能会通过增加咳嗽感受器的敏感性而增加咳嗽敏感性。
临床上存在一种在服用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）类降压药物后出现咳嗽的患者，即ACEI诱发的咳嗽患者，发生率约在5%～25%，占慢性咳嗽病因的1.7%～12%。实验时可将豚鼠置于一定容器中，正常呼吸空气和正常饲养，然后给动物吸入一定浓度的引咳剂（如辣椒素和柠檬酸）后，静脉注射ACEI（如依那普利等），观察咳嗽频率的变化，实验发现动物长期应用ACEI，均能使反射性咳嗽和自主性咳嗽增加。急性给予依那普利可使辣椒素诱发的咳嗽敏感性增高，但对柠檬酸诱发的咳嗽敏感性并不增高，也不诱发自主性咳嗽。这种对不同ACEI反应性的差异可能与所给药物剂量和时间的不同有关。该动物模型的建立无疑为预防及治疗ACEI诱发的咳嗽提供了研究工具。
事实上，绝大部分止咳药物的临床前研究都离不开豚鼠咳嗽模型。近年来随着咳嗽机制研究的深入，越来越多咳嗽外周靶点的拮抗剂相继得到开发，有些甚至已经开始了Ⅱ期临床试验。例如，TRP家族拮抗剂、ATP受体拮抗剂（P2X3）、钠离子道阻滞剂和神经肽拮抗剂在临床前的豚鼠动物模型研究中，均表现出显著的止咳效果，进而相关药物的研发进入了临床试验阶段。其中，在一项临床试验中，P2X3阻滞剂（AF-219，600mg，2次/d）治疗2周能够显著减少难治性咳嗽患者的咳嗽频率（总体下降70%），显示出极大的开发及应用前景。Usmani通过给雌性豚鼠雾化吸入柠檬酸（0.78mol/L）制备咳嗽模型，观察可可碱（可可粉中的二甲基黄嘌呤）的药理作用，发现可可碱可抑制柠檬酸刺激引发的咳嗽。同时体外研究发现可可碱可直接抑制辣椒素诱导的人类、豚鼠迷走神经的感觉神经元除极化，为开发新的镇咳药提供了理论依据。
在麻醉状态下，可直接予异物或电刺激等诱发建立咳嗽模型。曾有人利用异物刺激建立猫支气管炎症模型，继而机械刺激引发咳嗽。研究发现，气管的局部炎症可改变气道感觉传入神经元的表型和兴奋性，使咳嗽传导途径发生可塑性变化，同时参与咳嗽反射发生的中枢控制器可保护性抑制咳嗽的发生。具体研究方法是：将一根缝线固定于猫胸内气管，1周后气管缝合处充血明显，炎症细胞浸润，动物出现自主性咳嗽伴咳出大量黏液。炎症15～17天，机械性刺激猫呼吸道黏膜的不同部位，发现机械刺激气管缝合处炎症部位时，模型组动物咳嗽程度（包括咳嗽次数及咳嗽强度）较正常对照组重，而刺激其他部位包括喉部及其他处支气管黏膜，则模型组动物咳嗽症状与正常对照组无明显差异。炎症20天，继续刺激炎症部位及其他支气管黏膜时，咳嗽强度较前明显减轻。
虽然关于EB某些阶段的形态及病理生理改变并不十分清楚，但无可否认的是，建立的EB模型必须能重现人类EB的重要病理生理特征：咳嗽为主要或单一症状、无气道高反应性、有嗜酸粒细胞性气道炎症且激素治疗有效。
曾有人用多黏菌素B刺激建立无气道高反应性的豚鼠嗜酸粒细胞性气道炎症模型。具体方法：选择300～350g的Hartley豚鼠，麻醉后，经鼻给予多黏菌素盐水溶液［5mg/（ml·kg）］，每周两次，共3周。选择末次给予多黏菌素后6天为观察点，发现模型支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞明显增多，组织病理显示气管、支气管黏膜嗜酸性粒细胞浸润，肺泡结构正常。组胺支气管激发试验显示，模型组气道反应性与正常对照组无明星差异。予10−18、10−16和10−14mol/L辣椒素激发时，模型组咳嗽次数明显高于对照组，且咳嗽敏感性与气管上皮组织嗜酸性粒细胞浸润、损伤程度密切相关。神经肽受体拮抗剂FK-224可以降低辣椒素咳嗽敏感性。由于多黏菌素B仅是肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放组胺的刺激剂，并不是公认的抗原刺激剂，因此该模型是否能真正模拟人类EB的病因及其发生、发展，仍有待于进一步的探索。
从目前的临床资料来看，EB患者常合并有变应性体质，如合并有过敏性鼻炎、过敏性皮炎和皮肤过敏原测试阳性等。因此，EB很可能类似哮喘，属变态反应性疾病。已有学者模拟哮喘模型的制备方法，通过调节抗原激发的途径、剂量、时间，建立EB动物模型。
由于豚鼠的EB模型尚未得到其他学者的认可，存在较多争议，故使用其他动物（如小鼠）制备成熟且完善的EB模型就显得尤为重要。目前比较成熟的嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型是广州呼吸健康研究院陈莉延等通过OVA腹腔致敏及OVA滴鼻激发制备而成。详见如下：
陈莉延等选择9周龄、体重16～18g的SPF级BALB/c雌性小鼠，于第0、7、14天给予10μg OVA+1.3mg氢氧化铝生理盐水混悬液200μl腹腔注射致敏；再于21、22、23天连续3天滴鼻激发（具体方法是腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，再将0.02%的OVA溶液50μl经鼻逐滴滴入，每侧鼻孔25μl，三天共计150μl）；第24天首先使用Finepointe（FP）小鼠咳嗽检测软件进行咳嗽检测，6小时后采用有创气道阻力与肺顺应性检测系统（RC）检测小鼠的气道反应性，气道反应性检测完毕后，立即抽取肺泡灌洗液进行细胞分类计数及制作肺组织病理标本，观察气道周围炎症尤其是Eos的浸润程度。结果显示，OVA 10μg腹腔致敏、10μg OVA滴鼻激发可成功建立具有EB特征（咳嗽反射性增加，无气道高反应性，有气道嗜酸粒细胞性炎症，激素干预有效）的小鼠模型。该模型是在国际上首次建立的具有EB基本特征的小鼠模型，为EB发病机制的深入探究提供了有利的工具。该模型与小鼠哮喘模型的操作手段、变应原使用、致敏和激发方法均相同，区别点仅在于使用小剂量OVA进行滴鼻激发，减少了造模方法不同带来的差异。两者仅有气道反应性差异，排除了气道炎症差异的影响，为气道反应性发生机制的研究提供了新的模型选择。
谢佳星等选择5～6周龄、体重18～20g的SPF级BALB/c雌性小鼠，于第0、7、14天给予10μg OVA+1.3mg氢氧化铝生理盐水混悬液200μl腹腔注射致敏；再于28、29、30天连续3天雾化颗粒平均中位直径（mass median diameter，MMD）为8.6μm的1% OVA 15分钟激发；末次激发后第24、48、72及96小时采用RC系统检测小鼠的气道反应性，气道反应性检测完毕后，立即抽取肺泡灌洗液进行细胞分类计数及制作肺组织病理标本，观察气道周围炎症尤其是Eos的浸润程度。结果显示，采用大颗粒变应原进行雾化激发初步成功建立了具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的小鼠模型。但该模型由于未做咳嗽检测，所以目前仅能称该模型为具有明显的Eos气道炎症、但无气道高反应性的小鼠模型。
虽然有创方法为金标准，但其存在相应的缺陷，即不能重复测量且检测完毕后小鼠会死亡，这也不符合伦理；而无创肺功能检测法不仅能有效解决这一缺陷，而且在小鼠肺功能的快速、重复检测时，以及在一些必须要求动物为清醒状态的实验（如药物安全学）等，都有其存在的价值。故陈莉延等在有创肺功能EB模型的基础上建立了无创肺功能EB模型，具体方法除了肺功能检测法采用了无限制全身体积描记系统（WBP）检测小鼠的气道反应性以外，其他方法（包括致敏与激发阶段的OVA剂量以及造模方法）均与陈莉延等制备的有创肺功能EB模型相似，结果显示使用无创肺功能检测系统可以成功建立具有EB特征（咳嗽反射性增加，无气道高反应性，有气道嗜酸粒细胞性炎症，激素干预有效）的小鼠模型；另外陈莉延等还发现OVA10μg腹腔致敏、5μg OVA滴鼻激发也可以成功建立具有EB特征的小鼠模型（待发表）。
应用抗原多次致敏动物后，再用抗原激发，可使动物的咳嗽敏感性明显增高，可模拟过敏性咳嗽的病理生理过程。目前比较成熟的是参照Muraki等方法建立的豚鼠过敏性咳嗽模型。以200～250g豚鼠为例，第1天腹腔内注射环磷酰胺30mg/kg，第3天腹腔内注入2mg卵蛋白和100mg氢氧化铝的混悬液1ml，3周后腹腔内再加强注射一次卵蛋白0.01mg和氢氧化铝100mg的混悬液1ml，以致敏豚鼠。在加强免疫后3周，予雾化吸入10mg/ml卵蛋白溶液90秒激发，以诱发咳嗽。吸入辣椒素等致咳剂，观察致敏动物的咳嗽敏感性变化，以及一些药物的治疗反应。如国内吕寒静等在OVA激发24小时后，依次对正常组和致敏组豚鼠腹腔注射0.1mg/kg、0.3mg/kg和1.0mg/kg的NK1受体拮抗剂SR140333或NK2受体拮抗剂SR48968，观察吸入10−4mol/L的辣椒素溶液诱导的咳嗽敏感性，发现致敏豚鼠咳嗽敏感性显著高于正常对照组，NK受体拮抗剂能抑制致敏豚鼠卵蛋白激发后增高的咳嗽反应。Masaru等利用过敏性咳嗽模型的常用方法等对豚鼠进行致敏和激发，发现激发后72小时，模型具有以下特点：①豚鼠出现干咳，支气管扩张剂处理有效；②无喘息症状出现；③组织病理显示全气道的Eos炎症；④气道反应性轻度升高。因此，认为该模型可以模拟人类咳嗽变异型哮喘的CVA模型。目前，CVA模型的具体建立方法仍不成熟，尚处于探索的阶段。
也有观察豚鼠过敏性鼻炎咳嗽敏感性的研究，Brozmanova等予OVA腹腔注射卵蛋白10μg和氢氧化铝100mg的混悬液1ml致敏，4周后滴鼻激发（0.5%OVA，每次15μl）制备豚鼠过敏性鼻炎模型，雾化吸入不同浓度（0.05～1.6mol/L，倍数递增，雾化微粒大小为1.2μm）的柠檬酸引发咳嗽。评估于第六次鼻激发后1小时或3小时后及第九次激发后17小时或24小时出现的咳嗽。发现第六次鼻激发后1小时及3小时的柠檬酸咳嗽敏感性显著高于第九次激发后17或24小时者，表明增强的咳嗽敏感性只与滴鼻激发后的早期过敏反应有关。
胃食管反流性咳嗽（GERC）是慢性咳嗽的一个常见重要病因。以往文献曾报道的狗、兔或大鼠等胃食管反流模型，多通过贲门成形、全胃切除+食管-空肠吻合术等手术建立，手术复杂，术后死亡率高，模型建立困难。广州呼吸健康研究院利用重复酸灌注的方法模拟人胃食管反流，成功建立了豚鼠GERC模型。具体方法是：麻醉后豚鼠取仰卧位，用绷带将四肢固定，并将其头部垫高；口腔插入5F胃管至食管中、下段，胃管外端连接一静脉输液器，以8滴/min速率滴注0.1mol/L盐酸（含胃蛋白酶），每次20分钟，每天1次，连续14天后，观察其吸入辣椒素咳嗽敏感性变化，以及其肺病理改变。结果显示此模型酸灌注后，出现与国内外常用的食管炎模型的病理形态学相似的病理改变，即光镜下可见食管下段黏膜基底细胞层增生，乳头延长、角化过度；部分食管鳞状上皮过度增生、核增大、变圆；气管、支气管黏膜水肿、基底膜增厚，部分上皮脱落，黏膜和黏膜下层血管扩张、炎症细胞浸润。同时可引起豚鼠气道神经源性炎症及部分豚鼠出现咳嗽的症状。此方法成功复制了伴有气管、支气管黏膜炎症的豚鼠反流性食管炎模型，为探讨反流相关性呼吸系统疾病的发病机制提供了研究工具。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）动物模型的建立将模拟COPD的发病因素、病理过程和临床特征，有利于从细胞、分子水平上研究COPD伴随着肺部炎症、肺气肿、黏液分泌过多的气流阻塞病理生理发生机制及其防治方法。
建立COPD模型最常用的动物是大鼠和豚鼠，也有少数报道选择兔、比格犬等作为实验动物。慢性吸入纸烟烟雾、二氧化硫气体、联合烟熏及气管内注入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的混合刺激方法等是建立COPD动物模型的主要途径。吸烟是COPD的最主要致病因素，被动吸烟可以诱导出最真实的COPD。动物在被动吸烟以后会出现慢性支气管炎、肺气肿的病理改变、气道阻力增加、动态呼吸系统总顺应性下降等，呈现出COPD的主要特征。一般暴露3～5周后，动物可以出现杯状细胞增生、黏膜下腺体肥大，尤其是外周气道的杯状细胞增生、酸性黏蛋白分泌增多等病理改变。以豚鼠为例，1990年，Wright等报道了烟熏诱发豚鼠COPD的肺气肿模型：将豚鼠放置在烟熏的密室内，每天10支香烟，每天1次，一周5天，持续了1、3、6、12个月后，豚鼠不同程度地出现了类似人吸烟导致肺气肿时进行性的肺泡腔扩大及肺功能减退等改变。通过吸入纸烟烟雾后建立的豚鼠COPD模型，对辣椒素或柠檬酸的咳嗽敏感性可明显增高，除利用该模型研究COPD的咳嗽发生机制外，还可通过观察不同物质对该模型咳嗽敏感性的影响而开发新的COPD咳嗽新药。吸入二氧化硫气体是建立慢性阻塞性肺疾病动物模型的另一途径。以大鼠为例，常按Reid法改良建立大鼠慢性支气管炎模型：将100～200g的Wistar大鼠，每天置于熏箱内（维持温度22～26℃），吸入含10−6（体积分数）SO2混合空气，每周5～6天，共6周。病理学检查表现为气道黏液分泌系统增生、炎症细胞聚积和蛋白渗出增加等典型慢性支气管炎病理改变。
流行病学资料表明，吸烟及反复呼吸道感染在人类COPD的发生、发展及演变过程中起着重要的促进作用。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的最外层结构，系类脂质、多糖及蛋白质的复合物，即所谓的内毒素。LPS进入肺脏后，可以刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞合成释放一系列炎症介质，介导多种组织、细胞的损伤，引起慢性支气管炎局部的炎症反应，形成肺气肿。近年来，人们发现采用联合烟熏及气管内注入LPS的混合刺激方法建立的COPD模型更符合人类慢性支气管炎及阻塞性肺气肿的特点。具体方法：以体重为（270±20）g的雄性大鼠为例，第1、14天气管内注入LPS 200μg/200μl（可采用气管插管后注射药物），第2～28天上午，在容积为72L的密闭箱内接受5%烟熏0.5小时，肺组织病理可显示局限性肺泡型肺气肿和小叶中央型肺气肿，电镜下可见支气管上皮纤毛明显受损，Ⅱ型肺泡上皮增生及肺泡巨噬细胞活化等病理改变。
此外，让大鼠暴露于重工业化、有空气污染的城市中，也是建立COPD模型的方法之一。模型制备周期长，往往需要3～6个月，并存在着时间和空间的差异，但有利于研究因严重城市空气污染而发生慢性支气管炎的病理生理特征。
根据CHS的定义，在构建动物模型时应该尽量与其病理生理学改变类似，即在较低水平的温度、机械及化学刺激时即可表现出较为显著的咳嗽高敏感性，而以非特异性气道炎症为主或无明显的肺部炎症改变。流行病学研究已经提示空气污染和病毒感染是慢性咳嗽的危险因素，而且利用臭氧、二氧化硫、香烟烟雾及病毒感染构建的动物模型已有报道。制备CHS模型所采用的动物包括豚鼠和兔子，可参考表3-2。
大气层中平流层的臭氧（O3）是保护人类过多遭受太阳紫外线照射的主要气体，而地表臭氧浓度增加则可对心血管和呼吸系统造成氧化应激损伤。小鼠及豚鼠暴露于O3能够诱导气道嗜酸性粒细胞的募集增多，而且臭氧与咳嗽的研究已有相关报道。所选用的动物为雄性兔子（2.5～4 kg）或者雄性Dunkin-Hartley豚鼠（300～500g），具体的方法学如下：
（1）压力传感器连接上全身体积描记仪，并使暴露箱气流输出端与描记仪相连接。
（2）压力传感器与电脑工作站相连接，以记录和复制多种波动的图像数据、即时反应动物的呼吸压力变化。
（3）在箱体中放置领带夹式的麦克风，并与扩音器相连接，以便观察者能通过声音特征来判断是否出现咳嗽。
（4）豚鼠或者兔子放置于透明的暴露箱体之后，静置一段时间（15～30分钟）之后开始臭氧暴露实验：由臭氧发生器产生2～3ppm臭氧，气流流速为5L/min，暴露1个小时。
（5）臭氧暴露结束之后即刻开始柠檬酸雾化激发实验，柠檬酸浓度兔子为0.4～0.4mmol/L，豚鼠为30～100mmol/L，雾化10分钟。
（6）雾化开始后即由专业的人员计数豚鼠咳嗽的次数，通过计算机的判别及咳嗽的声音进行综合判断，注意咳嗽与喷嚏的区别。记录10分钟内动物的咳嗽次数。
二氧化硫（SO2）是燃煤及工业排放的主要污染物，动物实验提示SO2暴露能够导致气道狭窄、气道黏液高分泌及气流受限。SO2还能够增强豚鼠对辣椒素的咳嗽反射，导致咳嗽敏感性的增高。SO2诱导豚鼠CHS造模方法如下：
（1）选用雄性Dunkin-Hartley豚鼠，550～700g，放置于树脂玻璃箱体中，每天暴露于SO2（1000ppm）3个小时，暴露4天。每天暴露结束之后放回原来的饲养环境，自由进食。
（2）第5天，动物进行辣椒素诱导的咳嗽敏感性测试，所选用的辣椒素浓度为3、10、30μmol/L，雾化4分钟。通过豚鼠的呼吸波形及咳嗽声音监测是否为咳嗽的发生。
香烟烟雾（CS）暴露导致COPD发生的主要原因。香烟烟雾暴露的动物模型已经有大量报道。根据暴露的时程、有无辅助其他暴露因素如LPS和过敏原等，CS暴露所导致的气道炎症类型、肺部病理改变存在较大差异。以下介绍一种优化的CS诱导咳嗽高敏感性模型的制备方法：
（1）选用雄性Dunkin-Hartley豚鼠（350～550g），使动物固定在改良过的透明暴露箱中（7L），动物不受限制但只通过鼻子吸入香烟烟雾进行暴露实验。
（2）香烟烟雾暴露，暴露箱体通过导管与吸嘴连接，烟雾在泵的推力下未经稀释进行传输，每30秒钟吸入3秒钟香烟烟雾（25ml），通过控制香烟的数量（1～5支）来控制CS暴露的浓度大小。其余时间吸入正常的空气。持续暴露时长为30～35分钟。
（3）在不同时间节点进行柠檬酸和辣椒素激发的咳嗽敏感性测试，在暴露1小时、5小时及1、2、3、5、10天后进行柠檬酸咳嗽激发试验，柠檬酸浓度为0.3mol/L，雾化时间为10分钟；另外一组实验在暴露的2～5、8、10天后进行辣椒素咳嗽激发试验，辣椒素雾化浓度为10μmol/L，雾化时间为7分钟。
（4）柠檬酸激发的咳嗽敏感性在CS暴露1天之后均不同程度升高，暴露时长为2天时咳嗽敏感性最高，而且与对照组具有统计学差异；辣椒素激发的咳嗽敏感性在CS暴露4天后均显著增高，暴露时长为10天时咳嗽敏感性达到最大。
病毒感染是引起急性及亚急性咳嗽的主要病原体。已知能够引起人体咳嗽的病毒包括鼻病毒、流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒等。体外实验已发现了鼻病毒、呼吸道合胞病毒能够感染人体神经元细胞系，并上调咳嗽相关受体的表达（TRPA1以及TRPV1等）。但目前仅见副流感病毒和呼吸道合胞病毒诱导的豚鼠CHS模型。以下简要介绍3型副流感病毒（PIV-3）感染豚鼠的造模方法：
（1）选用雄性清洁级Hartley豚鼠，体重200～250g，饲养于相对无菌的环境，每12小时进行日夜交替循环，动物自由进食。
（2）豚鼠接种病毒：豚鼠腹腔注射氯胺酮（25mg/kg）及盐酸塞拉嗪（1.25mg/kg），使豚鼠进入轻度麻醉状态；豚鼠采取仰卧位，头部固定牢固之后使用移液枪进行滴鼻接种病毒，每个鼻孔滴入15μl，2分钟后在另外一个鼻孔进行重复滴鼻，最终滴入150μl含有病毒的溶液。
（3）病毒滴入后的第4天进行豚鼠咳嗽敏感性测试：豚鼠放置于全身体积描记仪，雾化吸入缓激肽（0.1mg/ml），递增浓度的辣椒素（0.1、1、3和10μmol/L）及柠檬酸（0.01、0.1和0.3mol/L），雾化3分钟，观察2分钟，计数5分钟内豚鼠的咳嗽次数。结果显示PIV-3感染豚鼠能够引起以上三种激发物诱导的咳嗽高敏感性。
此外，广州呼吸健康研究院的一项研究结果显示，豚鼠暴露于机动车密度较大的隧道环境（PM2.5浓度约300μg/m3），每天暴露12小时，连续暴露7～14天可以诱导豚鼠产生咳嗽高敏感性及非特异性气道炎症。暴露于重工业化大气污染比较严重的城市环境，也是建立大鼠COPD模型的方法之一。利用这种方法构建的动物模型周期长，往往需要3～6个月，且存在着时间和空间的差异，但有利于研究城市大气污染是否能导致慢性阻塞性肺疾病的产生及相应的致病机制。这种模型在国外已经有相应报道。
由于缺乏主诉，动物（尤其是小型动物）的咳嗽症状需要实验者作出准确的判断，并与打喷嚏、呼气反射和叹气等鉴别。不同动物的咳嗽症状存在不同的特点，实验者需要根据电生理、呼吸波形和声音的改变进行综合判断。一般来说，典型的咳嗽都应该是在深吸气后主动用力呼气，并伴爆震声，并同时满足以下三个条件：①动物咳嗽时具有特征性体位的改变：以豚鼠为例，咳嗽时，有伸出前脚、颈部伸向前、张口等特征性体位的出现；②动物咳嗽出现的特殊声音；③咳嗽时流速-时间曲线出现特征性的改变。而呼气反射的特点则是呼气前无深吸气动作，也无典型的咳嗽声音。动物的叹气动作虽然也是在深吸气后用力呼气，但缺乏典型的咳嗽声音。而动物打喷嚏时，外界进入体描箱的气体量及喷嚏产生前的加压相到喷嚏发生（即呼气相）所经历的时间均较咳嗽发生时小。借助某些用于评价动物咳嗽评价的软件系统，可以增加咳嗽判断的准确性（图3-2）。
咳嗽时流速-时间曲线的特征性改变是判断动物咳嗽的客观标准。我们知道，有效咳嗽取决于产生高速气流的能力和通过气道的速度，此过程取决于舌咽和迷走神经正常功能的输入和输出通路及气流与气道黏液之间的有效接触。在吸气相，声门开放深吸气，吸入＞50%潮气量到50%肺活量的气体，保持呼气肌处于理想的初长度-张力关系，从而产生更大胸膜腔内压。在加压相，声门闭合，同时肋间呼气肌和腹肌开始用力，胸膜腔内压明显增高。该压力较强制呼气锻炼时产生的压力高50%～100%，以产生保证有效咳嗽的高气流速率。在呼气相（咳嗽发生），包括两个气流爆发时相：高气流时相时流速峰值达11L/s，持续约30～50毫秒；低气流时相时气流由远端肺泡排出，流速约3～4L/s，持续约200～500毫秒，随肺容量降低渐降。根据实验用动物肺功能检查的体描箱的检查原理，动物咳嗽发生时，深吸气后用力呼气，箱内气体流量将会随着动物的胸膜腔内压和呼吸道流量的改变而发生明显的变化，通过监测体描箱内气体流量的变化，即动物咳嗽时流速-时间曲线的特征性改变，协助判断一定时间内动物咳嗽发生的次数（见彩图3-3）。
以豚鼠为例，动物咳嗽监测系统设置方法如下：豚鼠置于体描箱内，数据通过体描箱侧壁的流量传感器收集，经前置放大器传送至计算机监测咳嗽发生时流速-时间曲线的改变。监测咳嗽声波的麦克风置于体描箱内，咳嗽声经放大传送至计算机。另外，还可根据实验设计，在体描箱上配置雾化和/或局部气管内注射咳嗽刺激剂的端口（图3-4）。
目前，如何监测豚鼠的自发性咳嗽仍未有系统的报道。根据笔者的经验，在豚鼠造模之后，可以通过录音笔记录下豚鼠24小时内的所有声音，通过专业的声音分析软件如Adobe audition或者Cool edit进行声音波形及声音特征的综合判断，计数24小时内豚鼠的咳嗽次数。具体的方法如下：
1.选择比较合适的录音地点（周围的声音分贝<40dB，环境为较为清洁，避免周围环境对动物造成刺激），每只动物放在单独的箱体或者笼具中，尽可能避免撞击声的干扰。
2.选用保真度较高的录音笔，悬挂或者放置豚鼠触碰不到的地方，保证录下来的声音较为清晰，连续录下豚鼠24小时的声音。在录音的过程中，尽可能避免人为噪声的干扰。
3.使用声音分析软件对所录到的音频文件进行分析，根据豚鼠的声音特征及波形综合判断。豚鼠完整的录音波形及典型的咳嗽波形如图3-5和图3-6所示。图3-5展示的是8个小时内的声音波形图像，图像中高出基准线的部分包括了豚鼠的呼吸音、叫声及周围环境的噪声等，需要对每个进行单独判断；图3-6中的典型咳嗽波形呈现一个爆发式的上升，波形连接较为紧密，持续时间约为0.1～0.2秒左右。
由于小鼠生理解剖结构微小，声音信号极为微弱，小鼠咳嗽检测较为困难。陈莉延等在豚鼠咳嗽检测方法的基础上开发出Finepointe（FP）小鼠咳嗽检测软件，该软件通过Buxco无创肺功能检测系统体描箱，使用辣椒素雾化激发，在小鼠自由活动时，观察小鼠腹部运动情况，记录异常呼吸波形，并同时使用微型麦克风监测小鼠的咳嗽声音，从而建立了一种新的、接近自然情况且比较成熟的小鼠咳嗽检测方法（见彩图3-7）。
正如建立其他疾病动物模型一样，建立咳嗽动物模型时，实验者应根据不同的实验目的，进行实验条件参数的选择。需要注意以下几个方面的问题：①实验种属的选择；②引发咳嗽反射的咳嗽激动剂的选择；③选择清醒状态，还是麻醉状态建立动物模型；④如何确定观察指标测试的终点；⑤模型是否具有良好的重复性；⑥模型是否能模拟相关疾病咳嗽的发生；⑦造模过程中，当豚鼠吸入咳嗽激动剂造成气道狭窄而引起窒息时，应该在咳嗽激发试验前5分钟腹腔注射肾上腺β-受体激动剂，例如特布他林（0.5mg/kg），防止出现不必要的死亡；⑧实验过程需要做好自我防护措施，使用尾气收集装置或者保持实验室通风，避免吸入过多雾化气体对人体造成损害。
咳嗽动物模型的建立为深入了解咳嗽的发病机制及开发新型止咳药物提供有力的工具，但是我们在利用这个工具向临床转化的时候仍需要保持谨慎的态度。一个不可否认的事实，即很多药物在临床前的咳嗽动物甚至细胞模型中显示出极好的应用前景，一旦进入到临床试验之后大部分结果都令人失望。所以我们应该更加理智地认识咳嗽的动物模型。例如，在豚鼠及啮齿类动物中存在较为明显的轴突反射，而人体缺乏该反射；再者，动物模型评价止咳药的主要终点指标为咳嗽反射敏感性，而临床上的金标准为咳嗽频率或咳嗽严重程度，并非以咳嗽敏感性作为有效与否的判断指标。咳嗽动物模型在更加完善之后，将极大提高咳嗽的转化医学研究水平，并更好地服务于临床。