3.1 细菌
在自然界中，细菌的种类和数量均是最多的，平时我们在生活中提到微生物往往就是指细菌，它与我们的关系十分密切，其在环境中作用也是很大的，因此，它成为环境微生物学的主要研究对象。
3.1.1 细菌的个体形态和大小
细菌属于原核生物，为单细胞，即一个细胞就是一个个体。细菌的个体（也就是细胞）基本形态有三种：球状、杆状和螺旋状（见图3-1）。
图3-1 细菌的个体形态
（1）球状 细胞个体形状为球形，其直径为0.5～2.0μm，称为球菌。
各类球菌又可以根据其分裂后排列方式分为以下几种：单球菌，细胞分散而独立存在，如脲微球菌（Micrococcus ureae）；双球菌，两个细胞连在一起，如脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）；四联球菌，四个细胞连在一起成田字形，如四联微球菌（Micrococcus tetragenus）；八叠球菌，八个细胞叠在一起成立方体，如甲烷八叠球菌（Sarcina methanica）；链球菌，细胞排列成一链条状，如乳链球菌（Streptococcus lactic）；葡萄球菌，细胞不规则地排成一串，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
（2）杆状 细胞个体形状为杆状，其大小为（0.5～1）μm×（1～5）μm，称为杆菌。
杆菌中细胞长宽比比较大的为长杆菌，如枯草杆菌（Bacillus subtilis）；细胞长宽比比较小的为短杆菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）。另外，多个杆菌连成一长串的称为链杆菌；末端膨大成棒状的称为棒杆菌。
（3）螺旋状 细胞个体形状呈螺旋卷曲状，其大小为（0.25～1.7）μm×（2～60）μm。螺旋菌中螺旋的数目和螺距随细菌的不同而不同。其中，螺纹不满一圈的称为弧菌，如霍乱弧菌（Vibrio cholerae）；螺纹在一圈以上的称为螺菌，如紫硫螺旋菌（Thiospirillum violaceum）和红螺菌属（Rhodospirillum）。
还有一种比螺旋菌弯曲得更多、更长的菌体，称为螺旋体（见3.5节）。
另外，我们在环境中经常可以看到一种被称为丝状菌的细菌，在水体、潮湿土壤及活性污泥中都可以看到这种形状的细菌。在有的教材中将其列为第四种细菌形态。
所谓丝状菌，其实是由柱状或椭圆状的细菌细胞一个个连接而成的，外面有透明的硬质化的黏性物质包裹（称为鞘）。所以它实际上是一种细菌的群体形态，故从严格意义上来说，是不应把它列为细菌的个体形态的，但从实际应用的角度，这种分法也是具有价值的。环境中常见的丝状菌有浮游球衣菌（Sphaerotilus natans）、发硫菌属（Thiothrix）、贝日阿托菌属（Beggiatoia）、亮发菌属（Luecothrix）等。
在正常情况下，细菌的个体形态和大小是相对稳定的，故它也是细菌分类鉴定的重要依据。但是，环境条件的变化，如营养条件、温度、pH、培养时间等，会引起细菌个体形态的改变或畸形；不同的种类和菌龄的细菌个体，在个体发育过程中，细菌的大小有变化，刚分裂的新细菌小，随发育逐渐变大，老龄细菌又变小；另外，有的细菌种是多形态的，即在其生命的不同阶段，会有不同的个体形态出现，如黏细菌在生命的某一阶段会出现无细胞壁的营养细胞和子实体。
3.1.2 细菌的细胞结构
细菌是单细胞的原核微生物，但所谓“麻雀虽小，五脏俱全”，其内部结构相当复杂，各种结构保证了细菌作为一个独立个体能完成其生长繁殖等生命活动的各项功能。
细菌的细胞结构可分为一般结构和特殊结构：其中所有的细菌均有的结构（称为一般结构或基本结构）有细胞壁、细胞质膜、细胞质、内含物及细胞核物质等；而有的结构是某些种类的细菌所特有的（称为特殊结构），如芽孢、荚膜、鞭毛、黏液层、菌胶团、衣鞘等，特殊结构常常是细菌分类鉴定的重要依据。细菌细胞的结构模式见图3-2。
图3-2 细菌细胞的结构模式
3.1.2.1 细菌的一般结构
从细菌细胞最外层开始，由外向内，依次有下列的细胞一般结构。
（1）细胞壁（cell wall） 细胞壁是在细胞最外面的坚韧而略带弹性的薄膜。它占菌体的10%～25%。
①细胞壁的化学组成和结构 细胞壁的化学组成主要有肽聚糖、蛋白质和脂肪，另外还可能会有磷壁酸、脂多糖等。在所有的细菌中，只有胶膜醋酸菌（Acetobacter xylinum）和产醋酸杆菌（A.acetigenum）例外，它们的细胞壁是由纤维素构成的。
由于细胞壁组成的不同，可把细菌分成两大类：革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。革兰阳性菌和革兰阴性菌的划分是通过革兰染色实验来确定的（见3.1.5节）。
运用电子显微镜观察和其他分析研究手段，人们发现，革兰阳性菌和革兰阴性菌在细胞壁的化学组成和结构上有明显差异。革兰阳性菌的细胞壁比较厚（20～80nm），结构比较简单，含肽聚糖（包括以下几种成分：D-氨基酸、L-氨基酸、胞壁酸和二氨基庚二酸）、磷壁酸（质）、少量蛋白质和脂肪。革兰阴性菌的细胞壁比较薄（10nm），结构较复杂，分为外壁层和内壁层。外壁层分为三层，最外面是脂多糖，中间是磷脂，内层是脂蛋白；内壁层含肽聚糖，不含磷壁酸。细菌细胞壁的结构见图3-3。革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁化学组成的比较见表3-1。
图3-3 细菌细胞壁的结构
表3-1 革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁化学组成的比较
肽聚糖是一种独特的物质，其组成成分是在动植物中从未见到过的，因此细胞壁中肽聚糖层的存在几乎是所有原核生物的鉴别性特征。
革兰阳性菌和革兰阴性菌不仅在化学组成上不同，而且在各成分的含量上也有很大差异，革兰阳性菌的肽聚糖含量百分比要高于革兰阴性菌，而革兰阴性菌的脂肪和蛋白质含量要高于革兰阳性菌。
②细菌细胞壁的生理功能
a.保护原生质体免受渗透压引起的破裂作用。
b.保持和固定细胞形态。
c.为鞭毛提供支点，使鞭毛运动。
d.细胞壁的多孔结构可起到分子筛的作用，可以阻挡某些分子进入和保留蛋白质在间质（革兰阴性菌和细胞质之间的区域）。
细胞壁能保持和固定细胞形态可以通过两个实验来证明：一个为溶菌酶实验，用溶菌酶去除细胞壁后，发现所有的细菌形态都成为球状；另一个为质壁分离实验，将细胞置于高糖溶液中，使细胞内的水分外渗，细胞质收缩，但细胞的形态没有发生变化。
（2）细胞质膜（protoplasmic membrane） 位于细胞壁以内的所有结构，统称为原生质体，包括细胞质膜、细胞质及其内含物、细胞核物质。
细胞质膜（质膜）是在细胞壁和细胞质之间，紧贴在细胞壁内侧的一层柔软而富有弹性的薄膜，厚度为7～8nm。它是一层半透性膜，其质量占菌体的10%。
①细胞质膜的化学组成 细胞质膜主要由蛋白质（60%～70%）、脂类（30%～40%）和多糖（约2%）组成。蛋白质与膜的透性及酶的活性有关。脂类是磷脂，由磷酸、甘油、脂肪酸和胆碱组成。
②细胞质膜的结构 在电子显微镜下，可以看到细胞质膜的双层结构，上下两层为致密的着色层，中间夹一个不着色的层（区域）。对此，目前人们公认的解释是：磷脂分子构成膜的基本骨架，上下两层磷脂分子层平行排列，具有极性的磷脂分子亲水基朝向膜的内、外表面的水相，疏水基（由脂肪酰基团组成）在中间。蛋白质镶嵌在磷脂层中或膜表面，有的蛋白质由外侧伸入膜的中部，有的穿透膜的两层磷脂分子，膜表面的蛋白质还带有多糖。有的蛋白质在膜上的位置是不固定的，可以转动和扩散，因此，细胞质膜是一个流动镶嵌的功能区域。细胞质膜还可以内陷成层状、管状或囊状的膜内褶系统，位于细胞质的表面或深部，常见的有中间体。细胞质膜的结构模式见图3-4。
图3-4 细胞质膜的结构模式
③细胞质膜的作用 细胞质膜的功能有以下几种。
a.控制细胞内外物质的交换（吸收营养和排泄废物等）。膜的半透性以及膜上存在的与渗透有关的酶，可以选择性决定物质的进出细胞。
b.细胞壁合成的场所。膜上有合成细胞壁和形成横隔膜所需要的酶。
c.进行物质和能量代谢。膜上有许多重要的酶，如渗透酶、呼吸酶及ATP合成酶等。
d.膜内陷形成的中间体上有呼吸电子传递需要的酶系，具有类似高等生物线粒体的功能，它还与染色体的分离和细胞分裂有关，为DNA提供附着点。
e.与细菌运动有关。鞭毛基粒位于细胞膜上，是鞭毛附着的部位。
（3）细胞质（cytoplasm）及其内含物 细胞质是位于细胞膜以内，除核物质以外的无色透明的黏稠胶体物质，又称为原生质。细胞质由蛋白质、核酸、多糖、脂类、无机盐、水等物质组成。细胞质内含有各种酶系统，是细菌细胞进行新陈代谢的场所。
幼龄菌的细胞质稠密、均匀，富含RNA，易被碱性和中性染料着色，着色均匀。老龄菌缺乏营养，RNA被细菌作为氮源、能源和磷源而利用，使细胞着色不均匀。所以由染色均匀与否可判断细菌的生长阶段。
内含物是细胞质内存在的各种颗粒结构，它们担负着重要的生理功能。常见的细胞质内含物有以下几种。
①核糖体（ribosome） 核糖体是分散在细菌细胞质中的亚微颗粒，以游离状态或多聚核糖体状态存在，是合成蛋白质的场所。它由60%的RNA（rRNA）和40%的蛋白质组成。
在细菌（原核生物）的核糖体中，RNA（rRNA）有三种，分别为5S、16S和23S（S为沉降常数，用来衡量分子量的大小）。核糖体的沉降常数为70S（由50S和30S大小两个亚基组成），直径为20nm。
核糖体的作用是合成蛋白质，因此，核糖体的数量与蛋白质合成直接有关，当细菌处于旺盛生长时，每个个体内的核糖体数可达（1～7）×104个，生长缓慢时，可减少到2000个左右；一般细菌细胞中约有10000个核糖体。
②内含颗粒（inclusive granule） 成熟细菌细胞，在营养过剩时，细胞质内可形成各种储藏颗粒。如异染粒、聚β-羟基丁酸（PHB）、硫粒、淀粉粒等。内含颗粒的产生与菌种有关，也与环境条件有着十分密切的关系。当营养缺乏时，它们又可被分解利用。
a.异染粒（volutin granule） 异染粒主要由多聚偏磷酸、核糖核酸、蛋白质、脂类及Mg2+组成，可用蓝色的碱性染料（如甲苯胺蓝、亚甲蓝）使之染成紫红色。异染粒是磷酸盐的储备，在聚磷菌中富含异染粒。在生长的细胞中异染粒含量较多，在老龄细胞中被细胞用作碳源和磷源而减少。
b.聚β-羟基丁酸（poly-β-hydroxybutyric，PHB） PHB是β-羟基丁酸的直链聚合物，被一单层蛋白质膜包围。它为脂溶性，不溶于水，易被脂溶性染料苏丹黑着染，在光学显微镜下清晰可见。在假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、固氮菌（Azotobacter）、肠杆菌（Enterobacter）等细菌菌体内均可见有PHB的存在。当缺乏营养时，PHB可以被用作碳源和磷源。
c.硫粒（sulfur granule） 贝日阿托菌（Beggiatoa）、发硫菌（Thiothrix）、紫硫螺菌及绿螺菌（Chlorobium）等细菌能利用H2S作为能源，生成硫粒，积累在菌体内。当缺乏营养时，氧化体内的硫粒为
，从中取得能量。硫粒具有很强的折光性，可以在光学显微镜下很容易被看到。
d.肝糖粒（glycogen granule）和淀粉粒 有些细菌在含碳源丰富而氮源不足的培养基上生长时，会形成肝糖粒和淀粉粒。两者都能被碘液染色，前者被染成红色，后者被染成深蓝色。肝糖粒和淀粉粒可被细菌作为碳源和能源利用。
③气泡（gas vacuole） 在一些光合细菌和水生细菌的细胞质中，含有气泡，呈圆柱形或纺锤形，由许多气泡囊组成。气泡的主要功能是调节浮力。在含盐量高的水中生活的专性好氧的盐杆菌属（Halobacterium）体内含气泡量较多，细菌借助气泡浮到水面吸收氧气。
（4）核物质 细菌是原核生物，没有定形的细胞核（无核仁、核膜），但具有遗传物质DNA（脱氧核糖核酸），即核物质，又称为拟核（nucleoid），亦称为细菌染色体。
在细菌中，DNA纤维存在于核区，由环状双链的DNA分子高度折叠缠绕而成。如E.coli的菌体长度仅1～2μm，而其DNA分子总长可达1.1mm。由于细菌DNA 含有磷酸基，带有很强的负电荷，用特异性的富尔根（Fulegen）染色法染色后，可在光学显微镜下看见，呈球状、棒状或哑铃状。
细菌的拟核虽然简单，但它与其他生物的细胞核一样具有储存遗传信息、决定和传递遗传性状的功能，它是细菌的主要遗传物质。
许多细菌细胞还具有质粒（plasmid）。质粒是存在于染色体外的小分子环状DNA，它可以独立进行复制或整合到染色体上。它可以被遗传或者传递给后代。质粒的存在对细胞本身的生长和繁殖并不重要，但质粒上携带的一些基因可以给细胞带来新的特性，如使细胞具有抗药性，赋予细胞新的代谢能力，产生致病性及其他许多特性。
根据质粒的存在和传播类型将其分为游离质粒（episome plasmid）和结合质粒（conjugative plasmid）。游离质粒既可以整合到染色体上，也可以不在染色体上而存在。结合质粒可以在细菌结合时将自己的拷贝转给另外的细胞。
质粒在细菌生活中起着许多重要作用。它对微生物学家和分子遗传学家构建和转化重组细胞及基因克隆提供着有价值的作用。
3.1.2.2 细菌的特殊结构
常见的细菌特殊结构有以下几种。
（1）荚膜（capsule） 在一些种类的细菌中，能分泌一种黏性物质于细胞壁的表面，完全包围并封住细胞壁，使细菌和外界环境有明显的边缘，这层黏性物质称为荚膜。碳氮比高和强的通气条件有利于好氧细菌形成荚膜。细菌荚膜可以很厚（约200μm），称为大荚膜（macrocapsule）；也可以很薄（小于200μm），称为微荚膜（microcapsule）。荚膜是细菌分类的依据之一。
荚膜的含水量在90%～98%，主要化学成分是多糖、多肽、脂类或脂类蛋白复合体。如在巨大芽孢杆菌中，荚膜有多糖组成的网状结构，其间镶嵌以D-谷氨酸组成的多肽。
荚膜对染料的亲和力很低，不易被着色，在实验中可用负染色法（亦称衬托法）进行染色，即把细菌样品制成涂片后，先对菌体进行染色，然后用墨汁将背景涂黑，在菌体和黑色背景之间的透明区就是荚膜（见图3-5）。
图3-5 细菌的荚膜和负染色法
①荚膜的功能 荚膜的功能有以下几个。
a.保护功能，荚膜的存在有利于细菌对干燥的抵抗，也有利于防止细菌被吞噬和噬菌体的侵染，因此，荚膜的存在也是很多致病菌的特征（可以抵抗机体细胞的吞噬作用）。
b.当营养缺乏时，荚膜可以成为细菌的外碳源（或氮源）和能量的来源。
c.在废水处理中，荚膜能吸附废水中的有机物、无机固体物及胶体物，把它们吸附在细胞表面，有利于对其的吸收降解。
d.荚膜是分类鉴定的依据之一。
②细菌细胞结构和群体结构 另外有几个与荚膜有关的细菌细胞结构以及由细菌组成的群体结构（菌胶团），希望注意区分。
a.黏液层（slime layer） 有些细菌不产荚膜，其细胞表面分泌的黏性多糖物质疏松地附着在细胞壁表面，与周围环境无明显的边缘，称为黏液层。在废水生物处理中，黏液层具有吸附作用，并很容易因冲刷和搅动而进入水中，成为其他生物的有机物来源。
b.菌胶团（zoogloea） 当多个细菌个体排列在一起时，其荚膜互相融合，形成公共荚膜包藏的具有一定形状的细菌集团，称为菌胶团。在活性污泥中常能见到多种形态的菌胶团，如球形、椭圆形、蘑菇形、分枝状、垂丝状及不规则状。菌胶团的形成对于水处理有十分重要的意义，它是废水生物处理中常见的由细菌组成的群体结构（见图3-6）。
图3-6 菌胶团的形态
c.衣鞘（sheath） 在一些水生细菌中，如球衣菌属、纤发菌属、发硫菌属、亮发菌属、泉发菌属等，多个细菌呈丝状排列，表面的黏性物质硬质化，形成丝状菌，这个在外面包围的结构就是衣鞘。
上述荚膜、黏液层、菌胶团、衣鞘等结构，其化学组成主要都是糖类，故有的书上将它们统称为糖被（glycocalyx）。
（2）芽孢（spore） 某些细菌在其生活史的某一阶段或遇到不良环境条件时，会在其细菌体内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的内生孢子，称为芽孢。能产生芽孢的细菌种类包括好氧的芽孢杆菌属（Bacillus）和厌氧的梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、一个属的球菌（芽孢八叠球菌属Sporosarcina）和一个属的弧菌（芽孢弧菌属Sporovibrio）。芽孢的位置因种而异，有的是在菌体中间（如枯草芽孢杆菌），有的是在菌体的一端（如破伤风杆菌）。芽孢的位置、形状、大小等也是菌种鉴别的依据（见图3-7）。
图3-7 细菌芽孢的各种类型
芽孢的特点如下。
①芽孢的原生质高度脱水，含水量少（约40%），所以芽孢内代谢活动停止。
②芽孢的壁很厚，紧密结实，可分为三层：外壳层主要由硬蛋白组成；中层为皮层，由肽聚糖组成，含大量2，6-吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA）；内层由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。
③芽孢内含有大量的DPA，可达干重的15%，以钙盐形式存在，所以芽孢内钙含量高，DPA的存在是芽孢具有抗热性的主要原因。
④含有耐热性酶，在120～140℃还能生存几小时。
由于上述特点，芽孢对不良环境如高温、低温、干燥和有毒物质等具有较强的抗性。芽孢处于不活动的休眠状态，可以帮助细菌度过不良的环境，一旦外界条件变好，它可萌发成为营养细胞。由于芽孢的抗性最强，故我们在检查灭菌效果时，可以采用芽孢为指示，即以它作为灭菌效果是否彻底的标志。
（3）鞭毛（flagella） 鞭毛是从细菌细胞膜上的鞭毛基粒长出，并穿过细胞壁伸向体外的一条长丝状、波曲状的蛋白质附属物。鞭毛的直径为0.01～0.025μm，长度为2～50μm。
绝大多数能运动的细菌具有鞭毛，鞭毛是细菌的运动胞器。鞭毛的旋转、摆动使细菌可以迅速运动。一般幼龄菌活动活跃，而老龄菌鞭毛会脱落而失去活动能力。有鞭毛的细菌能运动，但并不是能运动的细菌都有鞭毛，有的细菌能借助其他方式运动，如滑行细菌（贝日阿托菌、透明颤菌、黏细菌等）。
有的细菌的鞭毛是单根的，也有多根的，可以是一端单生的或者两端单生的；也可以是成束的，一端丛生的或者是两端丛生的；也有的是周生的。鞭毛的着生位置、数量、排列方式等都与细菌的鉴定有关，它是细菌种的特征（见图3-8）。
图3-8 细菌鞭毛的着生位置
1—极端生；2—亚极端生；3—两极端生；4，7—两束极端生；5—周生；6—单根极端生；8—束极端生
鞭毛运动是靠细胞膜上的ATP酶水解ATP提供能量。由于鞭毛很细，无法直接观察，通常用鞭毛染色法将染料沉积在鞭毛上使之变粗，就可在光学显微镜下看见了；也可以直接在电子显微镜下进行观察。
（4）菌毛（fimbira）和性毛（pilus） 菌毛，又称为纤毛、伞毛、线毛或须毛，是一种长在细菌体表的纤细、中空、短直且数量较多的蛋白质类附属物，其功能是使菌体能附着于物体表面。菌毛的直径一般为3～10nm，长度为0.2～2μm，每菌数量可达250～300条，周身分布。菌毛多存在于G-致病菌中。
性毛，又称为性菌毛，是一类特殊的菌毛，存在于大肠杆菌和肠道菌表面，构造和成分与菌毛相同，但比菌毛长，且数量只有一根至少数几根。其功能被认为与细菌的遗传物质的传送（细菌结合）有关。
3.1.3 细菌的繁殖
细菌生活在适宜条件下，细胞体积、质量不断增加而开始繁殖。细菌一般被认为不存在有性繁殖，只进行无性繁殖。细菌的繁殖方式主要为裂殖，只有少数种类进行芽殖和孢子生殖。在适宜条件下，多数细菌繁殖速度极快，分裂一次需时仅20～30min。
（1）裂殖 裂殖是指一个细胞通过分裂而形成两个子细胞的过程。首先是DNA进行复制，两条DNA链各自形成一个核区，两个核区间形成细胞质膜，使细胞质分开，形成两个子细胞的细胞壁，最后形成两个大小一致的子细胞（见图3-9）。
图3-9 细菌的二分裂
对杆状细胞来说，有横分裂和纵分裂两种方式，一般细菌均进行横分裂（又称为二分裂）。个别种类的细菌，如绿色硫细菌，存在三分裂的方式，蛭弧菌中，存在复分裂的方式。
（2）芽殖与孢子生殖 芽殖是指在母细胞的表面（尤其是一端）先形成一个小突起，待其长大到与母细胞相仿后再相互分离并独立生活的一种繁殖方式。凡以这类方式繁殖的细菌统称为芽生细菌，包括芽生杆菌属（Blastobacter）、生微丝菌属（Hyphomicrobium）、生丝单胞菌属（Hyphomonas）、硝化杆菌属（Nitrobacter）、红微菌属（Rhodomicrobium）和红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）等十余属细菌。
少数细菌能由一个细胞形成许多分裂孢子或节孢子，与真菌的孢子不同，这些孢子有的很小，以致可通过细菌过滤器。
3.1.4 细菌的培养特征
在对细菌的研究中，经常要让细菌（通常是纯种）在各种培养基上生长，在不同的培养基上，不同种类的细菌会呈现不同的培养特征。这些培养特征也是对细菌进行分类鉴定或者判断其呼吸类型和运动性的重要依据。
首先来认识什么是培养基。所谓培养基是人工配制的供给微生物营养物质的基质。微生物在培养基上生长繁殖或进行某种生理活动。培养基有固体培养基（加入1.5%～2%的琼脂，在常温下凝固）、半固体培养基（加入0.3%～0.5%的琼脂，使之在常温下呈半固体状）和液体培养基的区分。
3.1.4.1 细菌在固体培养基上的培养特征
（1）菌落 细菌在固体培养基上的生长繁殖，由于受到固体表面的限制，无法自由活动，从而聚集在一起，就是菌落。所谓菌落是指将单个细胞接种到固体培养基上，在合适的条件下培养一定的时间，生长繁殖形成一堆由无数个个体组成的肉眼可见的群体。
（2）菌落特征 在细菌培养中，获得单个细菌个体的办法主要有稀释平板法和平板划线法。不同种类的细菌在不同的培养基上所出现的菌落特征是不同的（见图3-10）。菌落的特征主要有大小、形状、光泽、颜色、质地软硬、透明度等。菌落特征是细菌分类的依据之一。可以从三个方面来看菌落的特征：菌落表面的特征，如光滑还是粗糙、干燥还是湿润等；菌落的边缘特征，如圆形、边缘整齐、呈锯齿状等；纵剖面的特征，如平坦、扁平、隆起、凸起、草帽状、脐状、乳头状等。
图3-10 细菌菌落特征
纵剖面：1—扁平；2—隆起；3—低凸起；4—高凸起；5—脐状；6—草帽状；7—乳头状表面结构、形态及边缘：8—圆形，边缘整齐；9—不规则，边缘波浪；10—不规则，颗粒状，边缘叶状；11—规则，放射状，边缘花瓣形；12—规则，边缘整齐，表面光滑；13—规则，边缘齿状；14—规则，有同心环，边缘完整；15—不规则，似毛毯状；16—规则，似菌丝状；17—不规则，卷发状，边缘波浪；18—不规则，丝状；19—不规则，根状
菌苔是细菌在斜面培养基接种线上长成的一片密集的细菌菌落，不同种类的细菌所产生的菌苔也是不同的（见图3-11）。
图3-11 细菌在斜面培养基上的菌苔
3.1.4.2 细菌在明胶培养基上的培养特征
用穿刺接种法将细菌接种到明胶培养基上，如果该细菌能产生明胶水解酶，就能在培养基上看到不同形态的由于明胶水解而产生的溶菌区（见图3-12），这也是细菌分类鉴定的依据之一。
图3-12 细菌在明胶培养基上的生长特征
3.1.4.3 细菌在半固体培养基上的培养特征
半固体培养基由于琼脂含量比较少，细菌能在内部运动，因此可以用来判断细菌的运动性以及呼吸类型等（见图3-13）。
图3-13 细菌在半固体培养基上的生长特征
1，2—不运动性好氧菌；3—不运动性兼性菌；4—运动性好氧菌；5—运动性兼性菌
用穿刺接种法接种细菌到半固体培养基上，如果细菌在培养基表面及穿刺线的上部生长，为好氧菌；如果只在穿刺线的下部生长，为厌氧菌；如果在整条穿刺线都能生长，则为兼性菌。如果只沿穿刺线生长，为没有鞭毛、不运动的细菌；如果它还能穿透培养基扩散生长，则为有鞭毛、能运动的细菌。
3.1.4.4 细菌在液体培养基上的培养特征
在液体培养基上，细菌个体可以自由扩散生长，细菌在液体培养基上的主要培养特征有是否成膜、浑浊、沉淀等，也是分类的依据之一（见图3-14）。如枯草芽孢杆菌在肉汤培养基表面会形成无光泽、皱褶而黏稠的膜。
图3-14 细菌在液体培养基中的生长特征
1—絮状；2—环状；3—菌膜；4—薄膜状
3.1.5 细菌的物理化学性质
3.1.5.1 细菌表面电荷和等电点
在细菌体内和细胞膜表面存在大量的蛋白质，蛋白质由20种氨基酸组成（这部分内容将在后面的章节中详细描述）。氨基酸是两性电解质，在碱性溶液中表现带负电荷，在酸性溶液中表现带正电荷，在某一pH溶液中（等电点），正负电荷相等，表现为不带电荷的中性。
由氨基酸构成的蛋白质也是两性电解质，也呈现一定的等电点。细菌细胞壁表面含蛋白质，所以，细菌也具有两性电解质的性质。已知革兰阳性菌的等电点在pH 2～3，革兰阴性菌的等电点在pH 4～5，革兰染色不稳定菌的等电点在pH 3～4，而在一般情况下，细菌所处的环境溶液，包括培养基条件，其pH为中性，或略偏碱或偏酸，都高于细菌的等电点。所以细菌的游离氨基电离受到抑制，而游离羧基电离，细菌表面带负电荷。加上革兰阳性菌细胞壁的磷壁酸含有大量酸性较强的磷酸基，更加导致细菌表面带负电。
细菌表面所带的负电荷，对细菌具有重要的生理意义，它与细菌染色、细菌对营养物质的吸收等都有关系。
3.1.5.2 细菌的染色原理和方法
（1）细菌的染色原理 大多数细菌菌体是无色透明的，在显微镜下由于反差小而不易观察。通过染色，可增加菌体与背景的反差，在显微镜下可清楚地看见菌体的形态。另外，利用染色方法，还可以对细菌的某一结构进行特定的染色，以便于观察和鉴定。因此染色是微生物（细菌）研究中最基本也是最重要的手段。
在细菌染色中常用的染料有：属于碱性染料的结晶紫、龙胆紫、碱性品红（复红）、番红、美蓝（亚甲蓝）、甲基紫、中性红、孔雀绿等；属于酸性染料的酸性品红、刚果红、曙红等。不同的染料可以把细菌菌体染成不同的颜色，由于细菌表面通常带负电，所以碱性染料的使用比较多，但有些种类的细菌，如分枝杆菌（Mycobacterium）的某些种类，需用酸性染料染色。
对一些特殊的结构，需要用一些特殊的染料和方法。如细菌的鞭毛染色，通过把银离子沉淀到鞭毛表面，加粗鞭毛，以便观察。还有一些特殊颗粒物的染色等，也都是根据对象的特性采用一些专门的染色方法。
（2）染色方法 染色方法分为两大类：简单染色和复合染色。
简单染色是用一种染料染色，目的是为了增加菌体与背景的反差，便于观察。而复合染色常用两种或更多的染料或试剂，根据需要进行多次染色，以达到实验的要求。如区别不同细菌的革兰反应或抗酸性反应，或区别比较细菌的结构和差异等。在复合染色法中，最著名也是最常用的就是革兰染色法。
（3）革兰染色法 1884年，丹麦细菌学家Christain Gram发明了革兰染色法。
①染色步骤 革兰染色法是一种复合染色法，即通过多次染色达到目的，其主要步骤如下。
a.初染 用草酸铵结晶紫或龙胆紫染料，将菌体染成紫色。
b.媒染 用碘-碘化钾溶液（鲁哥液）进行媒染，这是一个中间处理步骤，目的在于降低细菌表面的等电点，形成草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物。
c.脱色 用乙醇或丙酮酸进行脱色，常用95%的乙醇，革兰阳性菌不被脱色而保持紫色，而革兰阴性菌被脱色。
d.复染 用品红或番红进行复染，革兰阳性菌仍呈紫色，而革兰阴性菌被染成红色。
②染色机制 关于革兰染色的机制有不同的解释，但目前比较公认的解释有以下两点。
a.革兰染色与等电点的关系 已知革兰阳性菌的等电点在2～3，革兰阴性菌的等电点在4～5，革兰阳性菌的等电点低于革兰阴性菌，说明革兰阳性菌所带的负电荷要多于革兰阴性菌，它与结晶紫的结合力大，用鲁哥液媒染形成复合物后，两者的等电点均有下降，但革兰阳性菌降得更多，因此它不易被乙醇提取和脱色。最后看到革兰阳性菌的结果为紫色。
b.革兰染色与细胞壁的关系 上述等电点不能解释在一些细菌中出现的因细胞结构被破坏而发生革兰染色结果变化的现象。研究人员通过电子显微镜对细胞壁的观察和对细胞壁化学成分的分析，发现革兰阳性菌的细胞壁脂类含量少，肽聚糖含量多，而革兰阴性菌则相反。因此，用乙醇脱色时，革兰阴性菌的脂类物质被乙醇溶解，细胞壁的孔径和通透性增加，乙醇较容易进入细胞体内将草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物提取出来；而在革兰阳性菌中，由于脂类物质少，肽聚糖多，加上乙醇的脱水作用，缩小了细胞壁上的孔径，降低了通透性，阻止了乙醇分子的进入，菌体不易被脱色。
革兰染色是细菌研究中最基本的技术手段之一。通过革兰染色方法几乎可把所有的细菌分成革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，是细菌分类鉴定的重要指标；另外，革兰阳性菌和革兰阴性菌在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都有明显的不同，因此，通过革兰染色就可以提供不少其他重要的生物学特性方面的信息。
3.1.5.3 细菌悬液的稳定性和稳定度
细菌在液体培养基中的存在状态有稳定和不稳定两种：一种为S型（光滑型），其细菌悬液很稳定，整个菌体为亲水基，均匀分布于培养基中，不发生凝聚，只有在电解质浓度很高时才会发生凝聚；另一种为R型（粗糙型），它具有强电解质，细菌悬液很不稳定，容易发生凝聚而沉淀，培养基很清。细菌的这种区别取决于细菌表面的解离层，取决于细菌表面的亲水基和疏水基的比例和平衡。
细菌呈半透明状态，光线照射菌体时，一部分光线透过，而一部分被折射，所以细菌悬液会有浑浊现象。浑浊度指标可以大致反映液体内细菌数量的多少。
3.1.5.4 细菌的多相胶体性质
细菌细胞质中含有多种蛋白质，其成分和功能各不相同，所以细胞质是个多相胶体，某一相吸收一组物质进行生化反应，另一相又吸收另一组物质进行另一种生化反应，在一个细菌体内可同时进行多种生化反应。
3.1.5.5 细菌的比表面积
细菌个体微小，但具有巨大的比表面积，如乳酸杆菌的表面积/体积约为120000。这有利于细胞吸收营养物质和加强新陈代谢。
3.1.5.6 细菌的密度和质量
细菌的密度为1.07～1.19（1.09）g/cm3，细菌的密度与菌体所含物质有关。蛋白质的密度为1.5g/cm3，糖的密度为1.4～1.6g/cm3，核酸的密度为2g/cm3，盐的密度为2.5g/cm3，脂类的密度小于1g/cm3，整个菌体的密度略大于水的密度。单个细菌的质量是很小的，为1×10-10～1×10-9mg。
3.1.6 细菌的分类和鉴定
研究微生物分类理论和技术方法的科学称为微生物分类学（microbial taxonomy）。分类学内容涉及三个既相互依存又有区别的组成部分——分类、命名和鉴定。
分类（classification）是根据一定的原则（表型特征相似性或系统发育相关性），对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定。
命名（nomenclature）是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称。
鉴定（identification或determination）是指借助现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。
在本教材的绪论部分，已经介绍了有关分类和命名的基本知识。对于环境科学工作者而言，在实际工作中接触到比较多的是有关鉴定的工作，因而，在此介绍有关微生物（细菌）鉴定的基本原理和方法。
3.1.6.1 细菌鉴定和分类的联系与区别
细菌的常规鉴定和细菌分类的工作方案从表面上看有相似之处，都包括菌株的分离、纯化和性状测定各环节，但实际上两者是有区别的。
（1）从工作目的来看，分类是按相似性或同源性界定和排列分类单元，也就是确定分类单元在分类系统中的位置。鉴定是对分离物进行识别，如在水的卫生检验中，我们关心的是是否存在指示菌——大肠杆菌，而该菌在分类上如何处置在此并不重要。
（2）鉴定方案是根据一群菌共同具有的（或缺少的）一个或多个特征为基础制定出来的。因此，鉴定方案是在分类研究的基础上制定出来的。只有当一群菌被分类以后，它的鉴定方案才能被设计出来。
（3）细菌鉴定中多采用特有的鉴别特征或实验，而不需像分类工作那样对分离物进行全面分析。鉴定中多选用形态和生理生化等表型特征。在上述特征无法鉴别时，需要借助于一些较复杂的方法，如DNA的碱基组成和核酸的同源性分析等。
3.1.6.2 细菌分类和鉴定的主要依据
鉴于微生物（细菌）形体微小、结构简单的特点，其分类和鉴定除了传统的形态学、生理学和生态学特征之外，还必须寻找新的特征依据。20世纪60年代以来，微生物学家从不同层次（细胞的、分子的等），用不同学科（化学、物理学、遗传学、免疫学、分子生物学等）的技术方法来研究和比较不同的微生物细胞、细胞组成或代谢产物，来寻找微生物分类和鉴定的依据。所以，实际上在现代微生物分类学中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都能被作为分类和鉴定的依据。现代微生物分类学已经从一门描述性的学科发展成为集多学科先进技术于一身的实验性科学。
（1）形态学特征 形态学特征始终被用作细菌（包括其他各类微生物）分类和鉴定的重要依据之一，其中有两个重要原因：一是它容易观察和比较；二是许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对稳定性。因此，形态学特征不仅是细菌分类的重要依据，也往往是研究系统发育相关性的一个标志。
由于普通光学显微镜和相差显微镜操作简便，所以是观察个体形态最常用的工具。而扫描电镜和透射电镜除用于超微结构的观察外，对于许多形态学特征的观察也常常会得到更好的效果。
形态学特征包括个体形态特征和培养特征。
个体形态指的是显微镜可以观察到的细胞形状、大小和排列方式，具有区分属及属上分类单元的作用。在观察细菌的个体形态时，要注意有些细菌在生活周期中有多形性变化，要注意其幼龄（6～8h）、生长对数期的菌体和老龄菌体的形态变化及革兰染色的变化。
培养特征是细菌在培养基上的群体特征，它们是可以直接用肉眼进行观察的一些特征，在分类中一般起辅助作用。它们包括固体琼脂培养基上的菌落形态、半固体琼脂培养基中的穿刺生长情况（需氧性、运动性）、液体培养情况以及明胶穿刺培养（胨化及其形状）。
（2）生理生化和生态学特征 由于细菌个体小，形态简单，所以，在细菌分类的早期，人们就注意引进生理和生化特征。这些生理生化特征与形态学特征相结合，在细菌不同等级的分类单元的分类与鉴定中起了重要作用。
生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较也是对其基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此，生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。许多细菌，仅仅根据形态学特征是无法区别和鉴定的，所以生理生化特征往往是细菌分类和鉴定的重要特征。
主要生理生化特征有能量代谢、营养（如碳、氮源利用谱）、代谢产物以及酶反应（接触酶和氧化酶）等。
生态学特征如氧的需求、温度、酸碱度、寄生、共生及致病性。
生境对于某些菌的分类有很重要的意义。例如，同为弯曲的或螺旋形细菌，生活在海洋中的为海洋螺菌（Oceanospirillum），淡水中的为水螺菌（Aquaspirillum），而弯杆菌（Campylobacter）则主要分布在动物体内。寄主范围对寄生菌来说常具有重要的分类价值。
细胞成分包括细胞壁、细胞膜的结构与组成，核酸、蛋白质等生物大分子的组成与序列等。细胞组分分析在现代细菌分类中占有非常重要的位置。它们是化学分类和核酸分析的主要研究内容，是确定化学型及细菌种、属的重要特征。细胞壁中氨基酸和糖类组分是放线菌及一些革兰阳性菌分种、属的主要性状。不同的细胞组分可以为细菌的分类、鉴定或系统发育关系提供佐证。
（3）血清学实验与噬菌体分型
①血清学反应 抗原（菌体）和相应的抗体（抗血清），在体内或体外均能发生特异性结合，称为免疫反应。在体外进行体液免疫反应，一般用血清进行实验，通常称为血清学反应。血清学反应具有高度特异性，在微生物分类和鉴定中，可以用来进行未知菌的鉴定和抗原组成的分析。
将血清学反应与有关技术结合，形成了各种准确、灵敏、快速的血清学细菌鉴定与分类技术，如凝集反应、沉淀反应（凝胶扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行分析比较，也可以用纯化的蛋白质（酶）进行分析，以比较不同细菌同源蛋白质之间的结构相似性。
②噬菌反应 与血清学反应相似，噬菌体也具有高度的特异性，它不仅可以对某一种细菌的寄生有专一性，就是对同种细菌的不同型也有特异性，所以，不仅可以用噬菌体来进行细菌种的鉴定，而且可以进一步把它分型。
（4）分子生物学的方法 由于细菌比较简单的形态学特征，又缺乏化石证据，对于细菌分类学需要确定其系统发育关系，也就是不同细菌类群之间的亲缘关系，单靠上述特征是不够的，无法获得精确的信息。这也是细菌的分类系统一直不完善的主要原因。
随着分子生物学的迅速发展和各种新技术的广泛采用，有关细菌种属间亲缘关系的分类和鉴定工作已经从一般的表型特征的鉴定，深化为遗传型特征的鉴定。
目前应用于细菌分类和鉴定的分子生物学方法主要有DNA中G+C含量的测定、DNA-DNA分子杂交、DNA-rRNA的同源性测定以及16S rRNA基因序列的测定等。
（5）数值分类法 数值分类法是借助于电子计算机将运算分类单元（OUT）（如细菌的菌株）按其性状的相似程度归类成表观群（phenon），目的是揭示生物分类单元之间的真实关系。该方法须有尽可能多的性状测定，并将这些信息转化为数值，对这些数值进行运行处理，必须借助电子计算机来完成。
数值分类法的一个重要原则是给分类单位的各种性状特征采用“等重衡量”原则，即对所有的性状给予相等的地位。该原则又称为Anderson原理，是在1757年由Michel Anderson提出的。
数值分类的优点是：减少工作者的主观偏见（在分类关系的估价和分类单元的建立上都是客观而明确的）；可以使分类过程实现自动化（将模式种的信息输入电子计算机，可进行自动检索）。
3.1.6.3 细菌鉴定的方法和过程
细菌的鉴定是确定一个新的分离物是否属于一个已被命名的分类单元的过程。主要包括分离培养、显微镜观察、生理生化实验、血清学检验和动植物接种等环节或技术。此外，还有噬菌体敏感性及抗生素敏感性实验等。
（1）检索表 细菌鉴定首先要有一个分类系统作基础。根据这个分类系统，找出各分类单元间相互区分的一系列特征，构成一个鉴定系统，即细菌鉴定的检索表。换言之，检索表由一系列有关细菌特征的问题构成，这些问题引导人们通过一个分类系统来确定一个菌株的分类地位。检索表有双歧式和表格式两种形式。
①双歧式检索表 由一系列是与否的问题构成，通过逐级分支的流程图将一个菌株确定到一个已知的分类单元。其中的问题（性状）必须逐级逐个回答，不能跨越。如在《一般细菌常用鉴定方法》（1982年）一书中的鉴定系统就是按双歧法编制的。按照该书的体系，首先根据供试菌株的细胞形状、革兰染色反应、对氧的需求及色素有无分为5个大群，即球状菌、革兰阳性杆菌、产色的革兰阴性杆菌、氧化性的革兰阴性杆菌和发酵性的革兰阴性杆菌，然后再用其他性状进一步区分。图3-15为该书中氧化性革兰阴性杆菌的检索表，从中可以看出常规鉴定的一个显著特点，即传统分类可以依靠少数性状来区分细菌的属（也包括种）。在分类研究中，检索表中的一个性状不确定，分离物就不能得到确切的鉴定。
图3-15 氧化性的革兰阴性杆菌
（引自：中科院微生物所.一般细菌常用鉴定方法.1982）
②表格式检索表（鉴定特征表） 只对分类群的特征进行总结，而不给分类特征以等级化的排列。表格式检索表往往包含较多的性状特征，因而看起来比双歧式复杂，但比双歧式优越。表3-2所列为芽孢八叠球菌（Sporosarcina）种的鉴别特征。表中记为“+”的结果是该分类单元中90%以上的成员为阳性的特征。由此看来，允许被鉴定对象的个别特征不确定。
表3-2 芽孢八叠球菌（Sporosarcina）种的不同特征①
①+表示90%或更多的菌株呈阳性；-表示90%或更多的菌株呈阴性。
注：引自：Holt J G.Bergey Manual of Determinative Bacteriology.9th.1994。
（2）鉴定工作的原则和步骤 鉴定工作的总原则是：在鉴定的最初阶段运用简单的鉴别方法，得到必要的信息后，通过实验尽量缩小分离物的归属范围，并减少以后的实验项目。当一个分离物大体被归到一个类群时，就应当遵循该群的性状或检索表中所采用的实验项目去做。归纳如下。
①保证鉴定的分离物是纯培养。
②根据掌握的材料将分离物由一个大的归属范围逐步缩小到较小的或特殊的类群，如光合细菌、革兰阳性球菌等。
③根据可得到的一切信息，进一步缩小分离物的归属范围到属、种。
④尽量减少所使用的实验项目。
⑤在鉴定中要有一个适当分类单元的标准菌株作对照，以证明本实验室采取的实验条件是有效的。
鉴定的最后结果应与分类手册中的模式菌株的性状描述进行对比来确定分类地位。
3.1.6.4 微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物的鉴定快速、准确、简易和自动化，一直是微生物工作者的研究热点。随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面的技术在微生物鉴定中被广泛使用，推动了微生物学的发展。
（1）微量多项实验鉴定系统 微量多项实验鉴定系统（细菌的自动化鉴定）是建立在数值（编码）鉴定的基础上的。
常规（传统）分类和鉴定需要测定项目众多，不能适应快速的需求，尤其是临床病原菌的鉴定。因此，应运而生地出现了多种类型的成套鉴定系统及编码鉴定方法。
该方法的基本原理是：针对微生物生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.1mL）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。实验时加入待检测的某一种菌液，培养2～48h，观察检测卡上的各项反应，按判定表判定实验结果，所得结果以数字方式表达（编码），并与数据库数据（手册或软盘）对照，或输入计算机后使用相应的软件，从而得出鉴定结果（包括属、种的名称，有的鉴定系统还可给予分类位置）。
微量多项实验鉴定系统已广泛应用于动植物检验、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是在临床检验中深受欢迎，发展迅猛。目前，已应用的快速、简便的商品化鉴定系统很多，例如法国生物-默里埃（Bio-Merieux）公司的API（analytic products Inc）/ATB，瑞士罗氏公司的Micro-ID系统、Enterotube系统、Minitek系统、R/B系统、IDS系统以及Spectrum10系统等。国内也有不少的编码鉴定以及商品化的微型鉴定系列。
微量多项实验鉴定技术的优点是能快速、敏感、准确、重复性好地鉴定微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间；其缺点是各系统差异较大，价格较贵，有的个别反应不准，难以判定。但是毫无疑问，这项技术是微生物鉴定技术向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。
（2）自动化的微生物鉴定仪 应用较早而普遍的有法国Bio-Merieux Vitex Inc公司生产的微生物鉴定仪（auto microbial system，AMS）。从接种（由充样机和封口机完成，由于充样机的负压能将已稀释好的菌液吸入试验卡的小池内，并由封口机密封）、培养和读数（由培养室保温于35.4℃，读数仪可将试验卡逐个拉出读数，并将结果输入计算机中心）到报告（由计数机将从读数仪所得结果收集，与数据库数据比较后，将结果打印输出）的全过程达到全自动化的程度。数据库由许多试验卡所组成。
还有半自动化的鉴定仪，也是Bio-Merieux公司生产的ATB（automatic testing bacteriology）。接种试验卡和培养是由人工完成，有多种不同的试验卡可选择，可对不同细菌进行鉴定。结果是由读数器和已装有模式菌株数据的计算机完成。另外还有美国安普中心生产的Biolog仪，与ATB相同的是接种试验卡和培养也是人工完成，试验卡分为革兰阳性和革兰阴性两种，鉴定结果由读数器和计算机完成，其特点是除可给出种名之外，也有相近种的树状谱。
这些微生物自动鉴定仪可以快速、自动对微生物同时或分别进行鉴定、计数、药敏实验等，在国内外得到广泛应用，但其价格昂贵，所用测试卡的耗费也很大。