第三章　显微镜检查

萋尔-尼尔逊（Ziehl-Neelsen）染色，也就是我们常说的抗酸染色，是由德国细菌学家Franz Ziehl（1859—1926）和病理学家Friedrich Neelsen（1854—1898）首先提出的。它是一种特殊的细菌染色方法，主要用于识别抗酸菌，如结核分枝杆菌细胞壁内含有大量的脂类物质称为分枝菌酸，可以耐受多种酸性介质的作用，抵抗普通的染色方法如革兰染色法，正因为如此，抗酸菌的染色不能像革兰染色那样容易。高浓度的染液、加热、加入酚以及延长染色时间都是为了提高染色的质量。但着色后，同样也很难脱掉颜色，碱性复红与分枝菌酸结合形成复红-分枝菌酸复合物，能够抵抗稀酸的漂洗，而细菌的荚膜分子量很高以至于室温呈蜡状，能够防止水系染液的渗透，因此，显微镜检查时抗酸菌仍然能够保持紫红色，而其他非抗酸菌经脱色后则被复染为蓝色，正是这种特征可以用于区分抗酸菌和其他普通菌。

凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均应进行痰涂片检查。确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。

1.凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰。

初治涂阳患者在疗程强化期末、治疗5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5个月和6个月）；复治涂阳患者在疗程强化期末、治疗第5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5个月和8个月），分别收集1份晨痰和夜间痰进行涂片检查。

2.初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在治疗第3个月末增加痰涂片检查1次。

3.确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查。

可用于显微镜检查的标本包括痰液、脓液、尿液、胸腹水、脑脊液以及组织标本或干酪块等。

1.具有100倍油镜和8～10倍目镜的双目显微镜。

2.天平，精确度为0.1g。

3.磁力搅拌器，具备加热功能（配制的染液量大时用）。

4.水浴锅。

5.振荡器。

6.生物安全柜。

1.可密封的、带螺旋盖的痰瓶容器，参考规格为:直径4cm，高度2cm（图3-1）。

2.无菌的一次性竹签、接种环或吸管。

3.载玻片。

4.高质量的碱性复红粉末（碱性复红的含量超过88%）。

5.乙醇（95%乙醇）。

6.水（去离子水或者蒸馏水）。

7.浓盐酸（37%，又名发烟盐酸），可以使用工业级盐酸。

8.高质量的亚甲蓝粉末（染料含量超过82%的生物染色剂）。

9.定性滤纸。

10.酒精灯或加热棒。

11.二甲苯。

12.镜油。

10ml经定性滤纸过滤的碱性复红储存液（8g碱性复红溶于95%乙醇溶液100ml中）加90ml 5%苯酚水溶液（5g苯酚水浴加热溶解后加入90ml热蒸馏水，待溶液冷却后，补充蒸馏水至100ml）充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤，置于避光试剂瓶中。

将50ml浓盐酸沿着瓶壁缓慢倒入950ml 95%乙醇中，搅拌混匀。注意:切勿将水向酸里加入！可能引起立即沸腾甚至喷溅到操作人员的脸上。操作强酸时穿实验服、戴手套。一旦发生酸引起的事故，应该用大量的水冲洗皮肤或者衣物。

以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液（0.3g亚甲蓝溶于50ml 95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml），充分振荡、混匀，用定性滤纸过虑即得亚甲蓝复染液，浓度为0.06%。

（1）初诊患者应收集3份痰标本。

1）即时痰:就诊时深呼吸后咳出的痰液。

2）晨痰:患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。

3）夜间痰:送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。

（2）治疗或随访患者应按期留取2份标本（晨痰、夜间痰）。

（1）当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的概率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间，或通风良好的留痰室内进行。

（2）深吸气2～3次，每次用力呼出，从肺部深处咳出，将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，拧紧盒盖。

（3）如果患者刚吃过东西，应先用清水漱口。装有义齿的患者在留取痰标本之前应先将义齿取出。

患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）:标本量一般在3～5ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、黏液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。按性状痰标本可分为以下几种:

标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，黏度较黏液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。

此类标本是因黏液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到黏液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。

标本外观以白色、黏稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多数为圆形、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于1∶3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低于1∶1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。

目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、黏度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于1∶2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，是不合格的标本。

1）应使用干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，如果是未进行脱脂的玻片应该以95%乙醇擦拭（或浸泡）脱脂。在玻片一端的1/3处注明实验室序号及标本序号。如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写。确保玻片上的编号与痰盒上的编号相同。

2）在生物安全柜内使用竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0.05～0.1ml。于玻片正面的右侧2/3中央处以画同心圆或者发卷的方式（图3-2）均匀涂抹成10mm×20mm左右的椭圆形痰膜，如果痰膜涂抹得很规范，在×100物镜下，从痰膜的一端看到另一端后约为100个视野。

3）涂抹后弃掉用过的竹签。如果用的是接种环，将接种环放于含玻璃珠（或沙子）的25%乙醇中，上下移动接种环以去掉痰标本，然后加热接种环直到变红。

4）涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰否则表明该玻片涂抹过厚或过薄（图3-3）。

取晨痰或24小时痰液，经121℃高压灭菌15分钟，待冷却后取5～10ml于体积为100ml玻璃容器内（瓶口直径约为2cm），加二甲苯0.3ml，振荡器振荡10分钟后取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载玻片盖于瓶口静置20分钟，取下载玻片。

痰膜朝上静置，室温自然干燥（一般约需要30分钟），不要在阳光下直晒。为了保证检验人员的安全，痰标本直接涂抹时，严禁同时对载玻片进行加热；严禁在自然干燥期间使用火焰进行加热。

涂片自然干燥后，放置在染色架上，相邻玻片的距离应保持在10mm以上（约间隔一个手指）；用酒精灯或者加热棒加热固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次）。不要加热时间过长或者在火焰上静止不动，这样痰膜可能变焦。

加苯酚复红染液，盖满玻片，火焰加热至出现蒸气（但勿使染液沸腾）后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染液。高海拔地区，如西藏和青海部分地区，液体沸点较低，应在出现蒸气后停止加热，保持5分钟，然后再加热，如此三次。流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。

自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满玻片，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。

滴加亚甲蓝复染液布满玻片，染色30秒，集菌法3～5分钟。流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去玻片上剩余的水。待玻片干燥后镜检。一张染色合格的痰玻片，痰膜肉眼观为淡蓝色，无红色斑点。

镜检与报告方式

通过萋-尼染色后，其他细胞和细菌染成蓝色的背景下，可见结核分枝杆菌呈现红色或粉色。它们通常是细杆状的、稍弯曲，但部分时候也会呈现出螺旋状；含较多结核分枝杆菌的标本内还能发现聚集成簇或分枝状排列的细菌（图3-4）。

参考显微镜的使用相关内容，在100倍视野下找到结核分枝杆菌。注意不要让镜头或镜油瓶直接接触痰膜，以防止交叉污染。然后按照下列步骤进行读片。系统性地对涂片进行观察，意即或从左至右，或从右至左连续地观察，当玻片移动到痰膜的一端时，纵向换行，并记住始终向一个方向。这样可以在观察时做到不遗漏又不重复（图3-5）。观察每个视野时，应停止移动玻片，直到观察完毕再移到下一个视野继续观察。

2.

至少观察300个高倍视野后才能报告阴性结果。一般10mm×20mm的痰膜用100倍油镜连续观察一行（约2cm的距离）有100个视野，如此观察3行就是300个视野，至少需要5分钟的时间。如果是阳性结果，可不需要观察这么多视野就可以作出判断。镜检人员在连续观察30分钟左右应该休息一会儿，防止眼睛过度疲劳以及判读的失误。结核分枝杆菌萋-尼染色后的结果报告应该按照以下标准分类:

（1）连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌，报告阴性。

（2）报告抗酸杆菌菌数:1～8条/300个视野，连续观察300个不同视野。

（3）抗酸杆菌阳性（1+）:3～9条/100个视野，连续观察300个不同视野。

（4）抗酸杆菌阳性（2+）:1～9条/10个视野，连续观察100个不同视野。

（5）抗酸杆菌阳性（3+）:1～9条/每个视野。

（6）抗酸杆菌阳性（4+）:≥10条/每个视野。

如果观察时发现抗酸杆菌分布不均匀，一个可行的办法是估计所有视野菌的总数再平均观察到的视野数，以此作为每个视野观察到的抗酸杆菌数。报告（3+）、（4+）时至少观察50个视野。

判读后马上记录结果，并用红笔记录阳性结果（痰涂片检查结果登记本见附件1）。

3.涂片保存

（1）镜检后应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。

（2）涂片上禁止标记镜检的阴、阳性结果。

（3）全部涂片按实验室登记本序号连续排列，存放于玻片盒内。

（4）涂片保存与实验室登记本记录应一致。初诊患者第一张涂片存入涂片盒后需预留出2个空位置，以备第二张、三张涂片检查后放入；随访患者第一张涂片存入涂片盒后需预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。

（5）根据结核病实验室登记本记录，按照弃旧存新的原则，保存近期3个月的全部痰涂片待复检。

1）年涂片量不足500张的实验室，必须保存全年的涂片待复检。

2）如果近3个月的涂片数超过1000张，可以按照弃旧存新的原则，保存近期1000张的涂片待抽查复检。

3）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。

1.食物残渣，患者在取痰之前应用清水漱口。

2.染液沉渣，定期过滤染液，新鲜配制的染液应使用新的试剂瓶。

3.存在于水或镜油中的环境抗酸菌，使用蒸馏水和严格去污的容器。

4.孢子，偶见常见卵圆形较分枝杆菌巨大。

5.酵母，可被染色成亮红色，经过加热固定后，形成较大的成群碎片。

6.来自于木或竹、棉、纸质的纤维，个别出现或出现于个别视野。

7.花粉，球状或短杆状较少见。

8.拨片划痕，常见为较长的平行线，较易辨别，因其存在于痰膜下层，正确对焦后可自行消失。

9.标本或涂片之间的污染。

10.每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。

11.染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。

12.严禁使用染色缸染色。

13.染色时勿使玻片上的染液干燥。

14.滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。

15.严禁物镜镜头直接接触痰膜。

16.作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。

17.完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。

18.登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。

19.准确记录和报告结果。

1.痰标本质量较差，应告知患者标本收集的正确方法。确认标本是痰而非唾液。

2.确认每份标本至少有3ml。

3.未挑选标本的适当部分涂片，选择脓样、干酪样、黏液分泌物涂抹制备玻片。

（1）不正确的涂片、染色和读片操作。

（2）标本量较少，造成痰膜较薄。

（3）痰膜较厚，光源不能充分透过痰膜。

（4）加热固定过度。

（5）加热固定不足造成痰膜脱落。

（6）苯酚复红染色时间过短或加热过程中沸腾，亚甲蓝复染过度。

（7）严格操作程序，可用已知阳性涂片作为对照完成整个过程。

（8）读片过程不规律，读片时间短，视野不足，判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。

4.读片人员色弱、色盲或有其他视觉障碍。

5.患者标本信息登录标记，结果记录报告错误，完整、准确地标注在痰盒侧壁而不是盖上、玻片和实验登记本。登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。准确记录和报告结果。双报告制度。

室内质量控制（quality control，QC）指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。

（1）容器:采用可密封的螺旋盖痰盒收集痰标本（参考规格:直径4cm，高度2cm）。痰容器应标明患者姓名、日期、编号（初诊患者门诊序号或随访患者登记号）和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰，3为次日即时痰）。

（2）痰标本性质:干酪痰、血痰、黏液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。

（3）初诊患者应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰），治疗中或复诊随访患者按期每次收集2份痰标本（夜间痰、当日或次日晨痰）。

（4）对当日不能进行涂片检查的痰标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。

（1）配制染色液的实验室必须按标准浓度和步骤配制染色液，实验室要有染色液制备配方和配制记录。

（2）染色液试剂瓶须标明染色液名称、浓度和制备时间。

（3）染色液置于棕色瓶内或者不透明塑料瓶内存放，避光保存。

（4）为监测染色液的质量，每次制备一批新的染色液之后，需使用未经染色的已知阳性和阴性涂片进行染色、镜检，并记录结果。

（1）新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。

（2）一张载玻片只能涂抹1份痰标本，且只能一次性使用，严禁清洗后重复使用。

（3）推荐使用一端有磨砂面的玻片。

（4）2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号，若使用无磨砂面的玻片，则必须使用玻璃刻刀在玻片一端的1/3处进行标注。

（5）大约0.05ml痰标本，在玻片正面右侧2/3的中央处均匀涂抹面积为10mm×20mm的卵圆形痰膜。

（6）将已干燥的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的5号字，则表明该玻片涂抹过厚。

（1）肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。

（2）染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。

（1）为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。

（2）按照结果报告标准仔细观察足够的视野数。

（3）每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。

（4）连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。

（5）采用自查和互查方式，至少抽查复检当日10%涂片，并填写室内质控登记表（附件2）。

室间质量评估（EQA）是通过进行批量测试、盲法复检并与网络中的其他实验室（上级或同级实验室）比对结果，对实验室的能力进行评价的过程。EQA包括实验室现场评价（on site evaluation）、盲法复检（blind rechecking）以及批量测试（panel testing）。

详见第八章。