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第二节 荧光染色镜检
一、技术原理
抗酸菌体经金胺“O”染色后，经蓝色光源照射激发，在高锰酸钾复染的暗色背景下呈现黄绿色荧光，杆状略弯曲。
二、适用范围
同萋-尼氏染色法。
三、检测样品
同萋-尼氏染色法。
四、仪器设备
1.荧光显微镜。
2.天平，精确度为0.1g。
3.磁力搅拌器，具备加热功能（配制的染液量大时用）。
4.水浴锅。
5.振荡器。
6.生物安全柜。
五、试剂耗材
1.可密封的、带螺旋盖的痰瓶容器，参考规格为:直径4cm，高度2cm。
2.无菌的一次性竹签、接种环或吸管。
3.载玻片。
4.金胺“O”（染料含量超过80%的生物染色剂）。
5.乙醇（95%乙醇）。
6.水（去离子水或者蒸馏水）。
7.浓盐酸（37%，又名发烟盐酸），可以使用工业级盐酸。
8.高锰酸钾。
9.定性滤纸。
10.乙醇灯或加热棒。
六、操作步骤
（一）试剂配制
1.金胺“O”初染液
金胺O 1g
苯酚50ml
乙醇100ml
补蒸馏水至1000ml
2.脱色剂
将50ml浓盐酸沿着瓶壁缓慢倒入950ml 95%乙醇中，搅拌混匀。注意:切勿将水向酸里加入！可能引起立即沸腾甚至喷溅到操作人员的脸上。操作强酸时穿实验服、戴手套。一旦发生酸引起的事故，应该用大量的水冲洗皮肤或者衣物。
3.复染液
0.5%高锰酸钾水溶液。
（二）痰标本采集
同萋-尼氏染色。
（三）涂片制备
同萋-尼氏染色。
1.涂片。
2.痰膜的干燥。
3.热固定。
4.染色
（1）初染:滴加金胺“O”初染液盖满玻片，染色15分钟；流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。
（2）脱色:自痰膜上端外缘滴加脱色剂，布满痰膜，脱色3分钟或至无色，流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。
（3）复染:滴加复染剂复染2分钟，沥去复染液，自然干燥，准备镜检。
七、结果判读
镜检与报告方式
1.读片的方法
玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以×10目镜、×20物镜进行镜检，发现疑为AFB的杆状荧光颗粒时，使用×40物镜确认。在暗背景下，抗酸菌发出杆状荧光（图3-6）。
图3-6 分枝杆菌荧光染色镜检形态
2.报告标准
（1）荧光染色镜检结果分级报告标准。
（2）荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸菌数）:1～3条/50视野。
（3）荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）:10～99条/50视野。
（4）荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）:1～9条/视野。
（5）荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）:10～99条/视野。
（6）荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）:≥100条/视野。
报告2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。
3.涂片保存
（1）涂片上禁止标记镜检的阴、阳性结果。
（2）全部涂片按实验室登记本序号连续排列，存放于玻片盒内，干燥避光处保存。
（3）涂片保存与实验室登记本记录应一致。初诊患者第一张涂片存入涂片盒后需预留出2个空位置，以备第二张、三张涂片检查后放入；随访患者第一张涂片存入涂片盒后需预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。
（4）根据结核病实验室登记本记录，按照弃旧存新的原则，保存近期3个月的全部痰涂片待复检。
1）年涂片量不足500张的实验室，必须保存全年的涂片待复检。
2）如果近3个月的涂片数超过1000张，可以按照弃旧存新的原则，保存近期1000张的涂片待抽查复检。
3）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。
八、临床意义
（一）诊断传染性肺结核
结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片AFB阳性的肺结核患者是社会上最主要的传染源，故痰涂片AFB检结果对诊断传染性肺结核是一项重要指标。
（二）评价化疗效果
结核病是由结核分枝杆菌引起的，现行化疗方案的制订也主要以结核分枝杆菌的生物学特性为依据，所以对化疗效果的评价，也将细菌学检查结果作为根据。
（三）为流行病学疫情评价服务
由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。
（四）涂片检查技术的优势
根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和国际防痨及肺部疾病联合会（International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，UNION）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制订的技术指南，痰涂片镜检是相应国家开展结核病控制项目时非常符合成本效益原则的细菌学实验技术。相对于临床和实验室经常采用的其他诊断和检查项目，高质量的痰涂片镜检有其自身特有的优势:
1.作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高。
2.技术相对简单，容易标准化和完成操作。
3.建立AFB检查时需设备投入少。
4.检查成本低，易于接受。
5.从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要。
6.对涂阳患者的治疗效果，能够作出及时和准确的评价。
九、自测试题
1.简述萋-尼氏法涂片染色镜检步骤及判读标准（掌握）
2.简述荧光法涂片染色镜检步骤及判读标准（掌握）
3.列举引起涂片结果假阳性和假阴性的原因及预防措施（各五条）（熟悉）
4.简述萋-尼氏染色原理（熟悉）
5.痰标本评价（了解）
6.如何开展室内质控（了解）