第四章　分枝杆菌分离培养

分枝杆菌固体培养是按照分枝杆菌的生长规律，根据分枝杆菌对营养和代谢需要的条件，人工营造出有利于分枝杆菌生长而抑制其他细菌生长的环境，达到分离的目的。依据标本的处理方法不同，固体培养可分为简单法、中和离心法。固体培养中最常用的是罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基，也是最具代表性的一种，其他的还有丙酮酸培养基、小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。固体培养基的优势在于可直接观察菌落的形态并可做分枝杆菌鉴定用，因此常用于临床标本的分离培养、鉴定、保存菌种及抗结核药物的敏感实验等操作，不足之处是结核分枝杆菌生长速度较缓慢。下面将介绍简单法培养、中和离心法培养和丙酮酸培养基培养分枝杆菌。

分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长。

适用于分离标本中的分枝杆菌。

痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。

1.Ⅱ级生物安全柜。

2.恒温培养箱。

3.涡旋振荡器。

4.带螺旋盖的前处理管。

5.独立包装的无菌刻度吸管。

6.试管架。

7.废液缸（注意:内盛消毒液不能腐蚀金属）。

8.医用废弃物袋。

9.高压灭菌器。

1.4%氢氧化钠（NaOH）溶液。

2.酸性改良罗氏培养基。

1.对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约1～2ml标本转移至相应前处理管中，旋紧痰标本容器螺旋盖。

2.视标本性状，将1～2倍的4%NaOH溶液加入到前处理管中，旋紧处理管螺旋盖，立即开始计时15分钟。

3.在生物安全柜内，将处理管在涡旋振荡器上涡旋振荡30秒直至痰标本充分液化。

4.将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置，直至15分钟计时结束。

5.拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。

6.用无菌吸管吸取前处理后的痰标本，保持培养基斜面水平，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基接种0.1～0.15ml（约2～3滴），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部（距离培养基顶端1cm处）。

7.将用过的吸管置于生物安全柜内的废液缸中，旋上培养管螺旋盖，避免完全拧紧，轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀地在斜面上铺开。

8.将培养基放置在斜面放置架上，保持培养基斜面水平向上。

9.连同斜面放置架将培养管置于恒温培养箱内，（36±1）℃孵育。

10.待24小时后，拧紧培养基螺旋盖，直立放置培养管，（36±1）℃条件下继续孵育。

1.接种后第3和7日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第八周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。详见附件3。

2.肉眼判定 结核菌的典型菌落形态为:不透明淡黄色、粗糙、干燥、凸起于培养基、有的成菜花样。如果发现培养基液化或者长真菌，则报告污染。

3.根据肉眼的初步判定，按以下生长情况记录结果:

无菌落生长报告培养阴性

菌落生长不及斜面面积1/4时，报告实际菌落数

菌落占斜面面积1/4 报告（1+）

菌落占斜面面积1/2 报告（2+）

菌落占斜面面积3/4 报告（3+）

菌落布满培养基斜面　　报告（4+）

如果发现培养基污染，按污染面积报告

污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/4 报告（C1+）

污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/2 报告（C2+）

污染菌有明显界限，且不超过斜面面积3/4 报告（C3+）

污染菌没有明显界限或布满培养基斜面　　报告（C4+）

4.初步判定、报告 按照培养的目的，按如下程序处理:

（1）以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。

（2）以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片染色显微镜检查和菌种鉴定实验，根据涂片和鉴定结果进行报告。

培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长时间，报告:分枝杆菌培养阳性。

经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告:结核分枝杆菌培养阳性。

5.结果解释 按生物学分类规则，结核菌属于分枝杆菌属，具有生长缓慢、抗酸染色等特性。结核菌是结核分枝杆菌复合群的笼统称呼。这一类菌主要包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌，它们的生长速度、菌落形态、生化特性、天然耐药属性非常相近，是结核病的病原菌。

从患者的标本中培养出结核菌，对诊断和评价治疗效果具有重要意义。

如果发现有黄色、光滑、湿润的菌落，可能为非结核分枝杆菌，即除结核菌以外的分枝杆菌。如果发现这类菌应送上级实验室进行菌种初步鉴定，并通知医生，嘱患者再留取一份标本，进行培养。如果再次非结核分枝杆菌培养阳性，将对诊断非结核分枝杆菌病和治疗具有重要意义。

如果发现典型结核菌菌落形态的细菌和污染菌并存，或者结核菌和非结核分枝杆菌并存，应立即将培养管送上级实验室进行分离。

质量保证包括室内质量控制（QC）、室间质量评估（EQA）、质量提高（QI）。其中室间质量评估又包括现场评价（on-site evaluation）、盲法复检（blinded-rechecking）、批量测试（panel testing）。结核病实验室对于固体培养的质量控制主要靠室内质量控制并结合现场评价来实现。在室间质量评估中，现场评价虽然是一种质量保证的实现形式，但需要一定的人力、物力，难以达到日常监控的目的。对于盲法复检，由于痰标本难以重复的特性，此方法很难实现；对于批量测试，质量控制样本准备方面还需要更多的技术投入，现阶段我国也很难实现。

1.室内质量控制（QC）

（1）制订适合本实验室的标准程序操作手册。

（2）实验人员经过培训合格。

（3）人员、设备、房间固定。

（4）配制试剂要有配制记录、准确性验证。

（5）各个使用的仪器需要有温度记录（一天两次）、检测记录、维修记录。（参见附件5.冰箱温度记录）

（6）培养基需要有制作记录、直立避光保存，使用之前要观察外观并进行无菌性测试、敏感性测试、生长度测试等。

（7）严格按照标准程序操作手册进行操作。

（8）所有实验结果和记录必须装订成册。

（9）每月进行数据统计分析，包括标本量、阳性率、涂阳培阳率、涂阳培阴率、污染率。

公式:

质量保证表格详见附件6.分枝杆菌固体培养质量控制表。

附：罗氏培养基的实验室内部质量控制

合格培养基的外观为斜面颜色新鲜，斜面表面光滑无气泡，无变形，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。

如果自制培养基，实验员应在制作完毕检查培养基发现问题分析原因；如果使用外部来源培养基，则在使用前，从以下几方面查验培养基，质量不好的培养基应弃去不用。

1.颜色　培养基颜色鲜艳，酸性罗氏培养基绿色略偏蓝，中性罗氏培养基为绿色；如果培养基异常，颜色灰暗、过蓝或过黄，均不能使用。

同一批制作的培养基如果呈现不同的颜色可能是由于混匀不充分。若颜色为非常深的蓝色可能是由于孔雀绿过多或者pH值太低（呈酸性）。非常深的黄色表明培养基中孔雀绿质量不好或者pH值太高（呈碱性）。凝固的培养基颜色变浅还可能是由于过高的温度所致。

2.质地　如果培养基液化或者很容易碎裂，可能是由于凝固温度太低或者时间过短。可随机抽取一批培养基中的1～2支培养管向手上敲打检测。当培养管转动时培养基应该不能够转动。质地较差的培养基不适合于培养接种。

3.凝固水　培养管的底部应该有少量凝固水。在接种前应倾去过多的凝固水。

4.匀质性　培养基中出现了较大块状物表明匀质性较差。

5.无菌性测试

（1）抽取5%的培养基，置于恒温培养箱内，（36±1）℃孵育。

（2）48小时后观察是否有细菌生长。

（3）培养基斜面无培养物生长，即为无菌性测试合格。

（4）如果发现任何一支培养基有培养物生长，则将同一批次的所有培养基置于（36±1）℃孵育48小时，逐一检查培养基，弃去有细菌生长的培养管，没有培养物生长的培养管拧紧螺旋盖保存备用。

（5）填写无菌测试记录，保存记录备查（表4-1）。

6.保存　培养基应在冷藏环境下置于密封袋内保存，保存期不超过2个月。

7.敏感性测试　每批次的培养基应进行敏感性测试，方法是通过接种结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis）标准株H ₃₇Rv或H ₃₇Ra进行检测。

菌悬液制备方法:

挑取菌株至磨菌容器，加入无菌生理盐水2～3滴，研磨后加入生理盐水制备McFarland NO.1悬液。

使用无菌生理盐水稀释至10 ^-3 mg/ml，然后用无菌22SWG接种环挑取菌液，接种至5支现有的质量合格的培养基和5支被检培养基2环（约0.02ml），最终接种菌量为2×10 ^-5 mg。稀释接种方法也可将菌液稀释至10 ^-4 mg/ml，使用无菌吸管接种0.2ml，36℃保持斜面水平放置24小时后直立继续培养，最终接种菌量同样为2×10 ^-5 mg（预计菌落形成单位不少于20个）。21天观察结果，填写敏感性试验结果记录（表4-1）。

符合以下两条标准即为敏感性测试合格:

（1）生长时间:培养基菌落平均初生长时间一般不超过21天。

（2）菌落形成单位（cfu）:不少于20个。

每次进行培养基敏感性检测的结果都应记录备查。

2.室间质量评估（EQA） 每年国家级结核病实验室对省级结核病实验室、每6个月省级实验室对市级实验室、每三个月市级结核病实验室对区县级实验室进行现场督导。

3.质量提高（QI） 实验室人员通过做好室内质量控制和室间质量控制达到质量提高。

1.留取标本后，尽可能立即进行处理，进行培养实验。如果不能立即处理，应短时在4℃冰箱保存，在7天内必须处理并进行培养实验。

2.将试剂放在4℃冰箱保存。将氢氧化钠分装成若干小瓶，每次使用新的氢氧化钠；如果需要缓冲液，也照此准备；从而保证每次操作前，氢氧化钠溶液（或缓冲液）及其容器没有接触过开放的痰标本。

3.如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作。

4.在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处理阳性级别低的标本，最后处理涂片阳性级别高的标本。

5.打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧烈振荡标本，振荡后静置几分钟，然后再打开盖子。

6.吸取处理过的痰标本时，应在吸管前端保持一段空气，减少吸管中标本溢出。

7.选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养，避免弱处理和过处理。

8.处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生物安全柜内敞开所有的标本容器或者离心管。

9.对于含有痰栓或者难以液化的标本，可以再加入预选高压灭菌的玻璃珠，以便涡旋时打碎痰栓；如果经过20分钟处理，痰标本中仍有未液化的痰栓，应避免吸取痰栓接种培养基。

10.接触过污染物（痰或其他标本）的无菌吸管应置于废液缸中。

11.正确标记培养管避免标本之间混淆。

12.控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢氧化钠到接种时间不能超过20分钟。当标本数量较多时，应分批处理，通常每批标本数量不超过6份为宜。

13.应将培养结果及时反馈给临床医生。7天以内的结果观察中如果发现污染，应告知患者及时收集另一份标本；如果发现快速生长分枝杆菌（7天内长出的菌落），立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。

14.结核菌可能在3～4周内生长。发现菌落并鉴定后立即报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满8周。

15.登记内容应包括:菌落初生长的日期以及阳性培养物的菌落特征；污染结果应随时检出并报告。

1.对痰涂片阴性的患者进行诊断。

2.获得菌种鉴定试验所需的纯培养物。

3.获得药敏试验所需的纯培养物。

MDR诊断:是获得药敏试验所需纯培养物的前提和基础。

疗效判断:是评价治疗效果的重要指标。

分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，碱性消化液中和后经离心富集，接种于中性改良罗氏培养基上，分枝杆菌能在中性的培养基上生长。

适用于分离标本中的分枝杆菌。

痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。

1.Ⅱ级生物安全柜。

2.恒温培养箱。

3.涡旋振荡器。

4.前处理管。

5.独立包装的无菌刻度吸管试管架。

6.废液缸（内盛的消毒液不能腐蚀金属）。

7.冷冻离心机（水平转子、具备防气溶胶盖子的离心杯（桶）、相对离心力能达到3000g）。

8.50ml螺旋盖离心管（每份标本需要一个离心管）。

9.天平。

10.高压灭菌器。

11.医用废弃物袋。

1.4%氢氧化钠（NaOH）水溶液。

2.2.94%枸橼酸钠（citrate-2H ₂O）水溶液。

3.N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NALC）。

4.NALC-NaOH混合溶液方法 每天即用即配，等体积混合4%氢氧化钠溶液和2.94%枸橼酸钠citrate-2H ₂O溶液。使用前每100ml混合液加入1g N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl L-cysteine，NALC），混合待用。

5.改良罗氏培养基。

6.0.067M的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）

试剂配制方法详见附件4.中和离心法固体培养试剂配制

1.对照标记，在生物安全柜内将约2～5ml痰标本置于相应的离心管中。

2.视标本性状，在生物安全柜内向前处理管内加入1～2倍体积NALC-NaOH混合溶液，并开始计时15分钟。

3.旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋振荡10～20秒，直至痰标本充分液化。

4.将离心管室温静置，直至计时15分钟结束。

5.在生物安全柜内打开离心管螺旋盖，向离心管中加入磷酸盐缓冲液至45ml，然后旋紧离心管螺旋盖。

6.在生物安全柜中将离心管成对放入离心桶（杯）中，旋紧离心桶（杯）螺旋盖。

7.从生物安全柜中拿出离心桶（杯）到低温冷冻离心机进行离心，设定制冷温度8～10℃，3000g离心15～20分钟。

8.在生物安全柜内打开离心桶（杯），取出离心管，小心弃去上清液，加入1ml磷酸盐缓冲液，混匀后用无菌滴管均匀接种于培养基上。每支培养基接种0.1～0.15ml（约2～3滴），拧紧螺旋盖。

9.将培养基放置在斜面放置架上，保持培养基斜面水平向上，放置于恒温培养箱内，（36±1）℃培养。

10.24小时后，将培养管直立放置，（36±1）℃条件下继续孵育。

同简单法。

同简单法。

同简单法。

同简单法。

同简单法。

1.阐述中和离心法培养操作中的关键步骤。

2.某实验室用中和离心法做的培养试验第二天发现有大量污染，应该从哪些方面找原因，请列举。

同简单法。

同中和离心法。

丙酮酸钠培养基主要用于从标本内分离牛分枝杆菌或作为本菌的传种及保存。

痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。

同中和离心法。

培养基为丙酮酸钠培养基，其他同中和离心法。

丙酮酸钠培养基:用1.6g丙酮酸钠代替改良罗氏培养基内的丙三醇，组分中增加4.0g葡萄糖。待盐类成分溶解后，调pH 7.2，加入30g马铃薯淀粉。

同中和离心法。

同简单法。

同简单法。

同简单法。

同简单法。

对于临床培养牛结核分枝杆菌具有很高的效果。

1.如何配制丙酮酸钠培养基？

2.丙酮酸钠培养基的突出优势是什么？

同简单法。