BacT ALERT 3D培养系统是法国梅里埃公司生产的第4代全自动培养系统。可检测临床标本的细菌、真菌、苛养菌、厌氧菌、结核分枝杆菌和其他分枝杆菌。

BacT ALERT 3D培养系统通过连续检测接种标本的培养瓶中CO ₂水平及其变化判断是否有分枝杆菌生长。培养瓶底部含有颜色感应器，此系统用一个比色计传感器和反射光监测溶解于培养基内的二氧化碳（CO ₂）的存在和生成。当培养瓶中有微生物生长将产生CO ₂，导致培养基pH值改变，传感器颜色从蓝绿色变为黄色。仪器每10分钟自动连续地检测，如有颜色改变将自动报警。

适用于BacT ALERT 3D系统检测分枝杆菌。

检测和分离血液、无菌体液样本和消化、去污染的临床样品。

1.生物安全操作柜。

2.双目生物显微镜。

3.高速离心机。

4.涡旋振荡器。

5.高压灭菌器。

BacT/ALERTMP处理瓶（红色瓶盖），产品号:251010，2～8℃保存。

MB/BacT抗生素补充剂，产品号:259760，2～8℃保存。该试剂由冻干的补充剂和MB/BACT复溶液组成。冻干的补充剂含有两性霉素B（0.0180%W/V），阿洛西林（0.0034W/V），萘啶酸（0.004W/V），多粘菌素（10 000U），甲氧苄啶（0.00105%W/V），万古霉素（0.0005W/V）和填充（bulking）试剂。补充剂的组成可以根据具体的特定的培养条件而进行调节改变。MB/BACT复溶液:油酸（0.05W/V），甘油（5%W/V），紫色染料（Amaranth 0.004%）和溶解于纯净水中的牛血清蛋白（1%），每个瓶中含有15ml复溶液。复溶液的组成也可以根据特定的培养要求条件而进行调节改变。

1ml一次性注射器

10ml一次性注射器

消毒灭菌的50ml圆锥离心管

pH 6.8磷酸盐缓冲液

分枝杆菌消毒液

N-乙酰基-L-胱氨酸粉末

乙醇棉签

N95口罩

帽子

手套

防护服

包括痰标本，支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本，体液，组织，脓肿物、吸出的脓液、创伤标本，大便和尿液标本。

1.视标本性状，加1～2倍体积（NALC-NaOH）消化液于处理瓶中。

2.拧紧处理瓶盖，置于涡旋振荡器上振荡约1分钟，使标本充分匀化，室温放置。

3.自加入（NALC-NaOH）消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。样本数较多时，应分批处理。

4.将已消化标本置于50ml离心管，加入灭菌PBS缓冲液至50ml刻度，3000g离心15分钟。

5.去上清，在沉淀物中加入1～2ml PBS缓冲液混匀，分别接种0.5ml沉淀物混合液于MP培养基瓶。

6.接种后，按照BacT/ALERT 3D操作手册的要求将接种的BacT/ALERT MP处理瓶放到BacT/ALERT 3D仪器中。每天注意仪器报警提示。

包括脑脊液、胸腔积液、腹水、心包积液、关节液、骨髓。

1.取0.5ml标本直接接种于MP培养基瓶内。

2.接种后，按照BacT/ALERT 3D操作手册的要求将接种的BacT/ALERT MP处理瓶放到BacT/ALERT 3D仪器中。每天注意仪器报警提示。

1.目测所有BacT/ALERT MP处理瓶和MB/BacT复溶液瓶是否见损坏或污染，如果处理瓶传感器转为黄色或呈混浊的瓶子有破裂或泄漏的情况出现则不能使用。培养基应该是清澈透明的，但在低于20℃时可能形成沉淀。不要把沉淀与浑浊混淆。用乙醇棉签或等效物消毒培养瓶盖。自然风干。

2.MB/BacT抗生素补充液的准备在使用前，在每个需要用于测试的MB/BacT抗生素补充剂小瓶中以无菌操作的形式加入10ml的MB/BacT复溶液，让这些块状固体溶解，轻轻混合内容物。一旦抗生素补充剂已进行了复溶，放置在2～8℃时有7天的保存期。如果每天标本量不多，可根据实际情况将抗生素补充剂复溶液分装保存在-20℃，保存期为一个月。

3.在进行细菌培养前，使用无菌技术，对每个用于培养的非无菌标本的BacT/ ALERT MP处理瓶，加入0.5ml的MB/BacT抗生素补充试剂，无菌标本加入0.5ml MB/ BacT复溶液。

4.在每一个BacT/ALERT MP处理瓶上标上相应患者的资料。

仪器报阳性和阴性结果处理方法:

1.阳性培养瓶均应进行涂片并进行抗酸杆菌传代培养。在生物安全柜中混匀培养基，用70%乙醇棉签消毒瓶塞，待自然风干。应用注射针取出标本进行涂片抗酸染色和传代培养，传代培养后用分枝杆菌消毒试剂消毒瓶塞。如果抗酸染色阳性，并确定无杂菌污染，进行药敏试验和分枝杆菌鉴定。如果涂片显示抗酸杆菌阴性，但显示有其他微生物存在，则应作革兰染色。如果抗酸涂片和革兰染色未找到细菌，则表示可能为假阳性，应将瓶子重新放入仪器中直至传代培养阳性或再次报告阳性或阴性。最初判断为假阳性后又再次显示为阳性的培养瓶应重新涂片并再次培养。如果革兰染色发现非分枝杆菌，重新进行一次去污染步骤并重复整个操作步骤或丢弃旧培养瓶取另一份标本培养。

2.阴性培养瓶在丢弃前建议目测混浊度。如果培养基呈混浊，根据实验室规范操作步骤进行抗酸染色并传代培养。清亮培养瓶则可丢弃，所有培养瓶丢弃前必须经过消毒步骤。

液体培养实验室登记本见附件7。

每盒BacT/ALERT MP培养瓶均附有质量保证证书，确认结核分枝杆菌ATCC 25117和胞内分枝杆菌ATCC 13950的质控结果符合要求。实验室针对每一新生产编号进行质控，采取以下步骤:

1.加0.5ml复溶的MP/BacT抗生素补充剂到每个需要进行测试的BacT/ALERT MP处理瓶中。

2.取质控菌株，在无菌生理盐水或Middlebrook7H9Broth中稀释至10 ⁴cfu/ml，而后加样0.5ml至代表BacT/ALERT MP培养瓶中。培养结果阳性出现预期时间见表4-2。

得到预期的结果后，可使用其余培养瓶检测临床标本；如果未获得预期的结果，请与生物梅里埃技术服务部联系。

3.无菌试验 对不同批次的BacT/ALERT MP培养瓶随机抽取一瓶培养瓶，直接放入仪器中进行培养，结果应是无菌生长。

4.仪器 每一个仪器均备有一个BacT/ALERT反射系数标准盒，用于质量控制和标准校正。所有质量控制应属于正常系统维护的一个部分，请查阅BacT/ALERT操作手册，以获取更多资料。

1.为了保证输入资料的完整性，每次最好只装一个培养瓶，一个培养瓶的装载程序完全结束后再装入另一个培养瓶。

2.装载前检查每一个培养瓶及其底部的颜色，底部变黄说明是阳性培养瓶，若有裂缝则不能使用。

3.为得到最佳结果，当显示的培养瓶类型为“GENERIC”时，采取手动输入培养瓶类型或遵守以下原则:如果培养瓶使用通用条码或不知其类型，一定要把MP培养瓶装载进MB孵育室，非MB培养瓶应加载BC孵育室；MB培养瓶禁止使用通用条码或匿名加载。

4.为确保培养瓶检测资料的完整性，每一次最好只卸下一个培养瓶，当该培养瓶的卸下过程完全结束后再进行下一个培养瓶的操作。

5.孵育箱的最适温度必须调节在35～37℃范围内，黄色的操作警报将会出现在控制箱或组合箱的“标准模块温度”屏幕上。

6.如果在2分钟内没有装卸培养瓶及其他相关操作，系统将自动终止培养瓶装卸载过程。

7.当怀疑标本中有玛尔摩分枝杆菌或者日内瓦分枝杆菌时，可能需要延长培养孵育的时间，或者需要加入Mycobactin J。

8.当用针筒进行研磨标本加样时，可能较为困难。为保证能够将足够标本接种去BacT/ALERT MP培养瓶中。组织样品必须研磨得非常细致。另外，为保证最大限度的分离可能存在的结核分枝杆菌细菌，当把样品注射到培养瓶中时应使用较大的规格的针头。

9.某些罕见的苛养的分枝杆菌有可能在BacT/ALERT MP培养瓶的培养基中不能生长。如果怀疑这些罕见的苛养的分枝杆菌为检测目标，建议采用特殊培养基或培养条件进行培养。

10.正在接受抗分枝杆菌药物治疗的患者的样品可表现为生长减弱。可能出现细菌在BacT/ALERTMP培养瓶的培养基中生长，但不能产生足够的二氧化碳以确定为阳性。

Bact/ALERT 3D培养系统优点具有快速、简便、准确等特点；缺点是仪器价格昂贵，试剂依赖进口，仅能做分枝杆菌分离培养不能检测药物敏感性。与传统固体方法比较，Bact/ ALERT 3D培养系统加快了结核分枝杆菌分离的速度，缩短了诊断时间，较传统固体方法缩短10～20天。