结核分枝杆菌复合群在含有对硝基苯甲酸（PNB）的培养基中生长受到抑制；大多数非结核分枝杆菌（NTM）菌种对一定浓度的PNB有耐受性，利用PNB培养基可以区分结核分枝杆菌复合群与其他非结核分枝杆菌。

非结核分枝杆菌（NTM）指除结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌外的所有分枝杆菌。

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温培养箱。

含PNB（500μg/ml）的改良罗氏培养基；中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

无菌磨菌管/无菌带螺旋盖磨菌瓶，无菌玻璃珠；麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）；培养管；22SWG标准接种环；无菌吸管；无菌吸头；移液器；无菌试管；无菌培养管；培养管架。

堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）ATCC 12478CMCC（B）95013；结核分枝杆菌H ₃₇Rv ATCC 27294CMCC（B）95053。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做PNB试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌管中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌管底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入无菌生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ ml的菌液。同样制备阳性对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和阴性对照菌株H ₃₇Rv的菌悬液。

2）在磨菌瓶上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入装玻璃珠的磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒；静置15分钟；在生物安全柜内小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，再静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液约1ml，转移到另一支无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊；逐步加无菌生理盐水直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备阳性对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和阴性对照菌株H ₃₇Rv的菌悬液。

取无菌培养管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，使用移液器取0.5ml的1mg/ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的培养管中，终浓度到10 ^-1 mg/ml。

取1管中性改良罗氏培养基和1管含PNB的改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22SWG标准接种环分别蘸取1环（即0.01ml）10 ^-1 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10 ^-3 mg/管。接种后的培养基置于培养架上，置于恒温培养箱37℃培养。

同样接种阳性和阴性对照菌株。

于接种后3～7天观察，以后每周观察一次结果，直至孵育4周，同时记录PNB培养基和中性改良罗氏培养基上菌落生长情况。快速生长的非结核分枝杆菌一周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌4周报告结果。结核分枝杆菌复合群在PNB培养基上不生长。

如阳性对照不生长或阴性对照生长，本次实验结果为无效。

1.此试验必须有阳性对照菌株堪萨斯结核分枝杆菌和阴性对照菌株结核分枝杆菌H ₃₇RV。

2.有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

4使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

5.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外线照射2小时，对分离培养实验室紫外线照射2小时消毒。

PNB阳性结果判断为非结核分枝杆菌（NTM）菌种，但PNB阴性结果初步认定为结核分枝杆菌复合群。

1.NB试验临床意义。

2.PNB试验操作步骤。

3.PNB试验原理。

4.PNB试验注意事项。

5.非结核分枝杆菌鉴别方法。

6.非结核分枝杆菌的分类。

结核分枝杆菌复合群在28℃的孵育环境中不能生长；而非结核分枝杆菌菌群的大部分分枝杆菌可以生长。

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温培养箱。

（1）中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

（2）无菌磨菌管/无菌带螺旋盖磨菌瓶；无菌玻璃珠；麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）；培养管；22SWG标准接种环；无菌吸管；无菌吸头；移液器；无菌试管；无菌培养管；培养管架。

（3）堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）ATCC 12478CMCC（B）95013；结核分枝杆菌H ₃₇Rv ATCC 27294CMCC（B）95053。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做PNB试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌管中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌管底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入无菌生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ ml的菌液。同样制备阳性对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和阴性对照菌株H ₃₇Rv的菌悬液。

2）在磨菌瓶上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入装玻璃珠的磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒；静置15分钟；在生物安全柜内小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，再静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液约1ml，转移到另一支无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊；逐步加无菌生理盐水直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备阳性对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和阴性对照菌株H ₃₇Rv的菌悬液。

取无菌培养管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，使用移液器取0.5ml的1mg/ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的培养管中，终浓度到10 ^-1 mg/ml。

取2管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22 SWG标准接种环分别蘸取1环（即0.01ml）10 ^-1 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10 ^-3 mg/管。接种后的培养基置于培养架上，一管置于恒温培养箱28℃培养，一管置于37℃培养。

同样接种阳性和阴性对照菌株。

于接种后3～7天观察，以后每周观察一次结果，直至孵育4周，同时记录28℃和37℃培养的培养基上菌落生长情况。结核分枝杆菌复合群在28℃不生长。

如阳性对照不生长或阴性对照生长，本次实验结果为无效。

1.每次试验必须有阳性对照菌株堪萨斯结核分枝杆菌和阴性对照菌株结核分枝杆菌H ₃₇Rv。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.要严格控制28℃和37℃的生长温度。

4.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

5.使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

6.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒柜内紫外照射2小时，对分离培养实验室紫外照射2小时消毒。

在28℃生长阴性而37℃生长阳性的认定为结核分枝杆菌复合群；在28℃和37℃生长均阳性的为非结核分枝杆菌。

过氧化氢酶是胞内、可溶性酶，能够分解过氧化氢为水和氢，可以通过向培养物中加入过氧化氢，来观察反应混合物中是否有气泡产生来检测酶的活性。多数非结核分枝杆菌经68℃处理一定时间后，其过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温水浴锅。

1.试剂 A.pH=7.0、1/15M PBS（无菌）；B.30%H ₂O ₂（过氧化氢）；C.10%吐温-80水溶液（121℃灭菌10分钟，4℃保存，2周内使用）。

2.无菌磨菌管；接种环；无菌吸管；无菌试管；试管架。

3.堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）ATCC 12478CMCC（B）95013；结核分枝杆菌H ₃₇Rv ATCC 27294CMCC（B）95053。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做耐热触酶试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中，使用无菌吸管吸取1.5ml试剂A到磨菌管中，用火焰消毒的接种环刮取2～3周的新鲜菌落约5mg，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样的菌悬液。吸取菌悬液到标记好样品编号无菌试管中备用；同样制备阳性对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）；阴性对照菌株，H ₃₇Rv的菌悬液。

将装有菌悬液的试管放于68℃水浴20分钟，取出后立即冷却；缓缓加入0.5ml等量混合的B、C（临近使用前配制）反应液。阳性对照堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）菌悬液和阴性对照为H ₃₇Rv的菌悬液同样做如上反应。

试管中有持续小气泡产生的为阳性；10～20分钟仍无气泡产生的为阴性；空阴性对照无气泡产生。

如阳性对照无气泡或阴性对照产生气泡，视本次实验结果为无效。

1.每次试验必须有阳性对照菌株堪萨斯结核分枝杆菌和阴性对照菌株结核分枝杆菌H ₃₇Rv。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

2.菌落需要在含试剂A中研磨，也可以使用磨菌瓶进行菌落研磨。

3.B、C试剂在使用前临时配制。

4.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

5.使用过的试管、磨菌管、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

6.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外照射2小时，对分离培养实验室紫外照射2小时消毒。

耐热触酶试验阳性结果判断为非结核分枝杆菌（NTM）菌种，但耐热触酶试验阴性结果为结核分枝杆菌复合群和部分的NTM，即耐热触酶试验结果阴性并不能认定为结核分枝杆菌复合群。

一定浓度的噻吩-2-羧酸肼（TCH）对牛分枝杆菌有抑制生长的作用；而对结核分枝杆菌无抑制作用。

主要用于区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温培养箱。

含TCH（5μg/ml）的改良罗氏培养基；中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

无菌磨菌管/无菌带螺旋盖磨菌瓶，无菌玻璃珠；麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）；培养管；22SWG标准接种环；无菌吸管；无菌吸头；移液器；无菌试管；无菌培养管；培养管架。

牛分枝杆菌（ M. boive）CMCC（B）93006；结核分枝杆菌H ₃₇Rv ATCC 27294CMCC （B）95053。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做TCH试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌管中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌管底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入无菌生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ ml的菌液。同样制备阳性对照菌株H ₃₇Rv和阴性对照菌株牛结核分枝杆菌的菌悬液。

2）在磨菌瓶上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入装玻璃珠的磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒；静置15分钟；在生物安全柜内小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，再静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液约1ml，转移到另一支无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊；逐步加无菌生理盐水直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备阳性对照菌株H ₃₇ Rv和阴性对照菌株牛结核分枝杆菌的菌悬液。

取无菌培养管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，使用移液器取0.5ml的1mg/ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的培养管中，终浓度到10 ^-1 mg/ml。

取1管中性改良罗氏培养基和1管含TCH的改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22SWG标准接种环分别蘸取1环（即0.01ml）10 ^-1 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10 ^-3 mg/管。接种后的培养基置于培养架上，置于恒温培养箱37℃培养。

同样接种阳性和阴性对照菌株。

于接种后3～7天观察，以后每周观察一次结果，直至孵育4周，同时记录TCH培养基和中性改良罗氏培养基上菌落生长情况。结核分枝杆菌在TCH培养基和中性改良罗氏培养基上菌落的生长情况相同；牛分枝杆菌在中性改良罗氏培养基生长良好，在TCH培养基上生长受到抑制。

1.每次试验必须有阳性对照菌株结核分枝杆菌H ₃₇Rv和阴性对照菌株牛结核分枝杆菌。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

4.使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

5.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外线照射2小时，对分离培养实验室紫外线照射2小时消毒。

TCH阳性结果判断为结核分枝杆菌，TCH阴性结果可能为牛结核分枝杆菌。

结核分枝杆菌能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二胺盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛分枝杆菌和部分NTM因不能产生硝酸盐还原酶，因此可用于结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别。

主要用于区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温水浴锅。

A试剂:硝酸盐溶液NaNO ₃（0.085g）溶100ml PBS（pH 7.0、1/15M）内，121℃灭菌20分钟，每管分装2ml；B试剂:35%的浓盐酸等倍稀释；C试剂:0.2%氨基苯磺胺水溶液（4℃保存，4周内使用）；D试剂:0.1%N-甲萘基乙烯二胺盐酸盐水溶液（4℃可保存4周）；E试剂:锌粉0.1g。

无菌磨菌管；接种环；无菌吸管；无菌试管；试管架。

牛分枝杆菌（ M. boive）CMCC（B）93006；结核分枝杆菌H ₃₇Rv ATCC 27294CMCC （B）95053。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做硝酸还原试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中，使用无菌吸管吸取2ml试剂A到磨菌管中，用火焰消毒的接种环刮取2～3周的新鲜菌落约5mg，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样的菌悬液。吸取菌悬液到标记好样品编号无菌试管中备用；同样制备阳性对照菌株H ₃₇Rv；阴性对照菌株牛结核分枝杆菌的菌悬液。

将装有菌悬液的试管和含2ml试剂A的空白对照试管放于37℃水浴2小时，试管取出后立即冷却；缓缓加入1滴试剂B和试剂C、D各2滴，混匀。阳性、阴性和空白对照管均添加同样试剂反应。

试剂混匀后试管内液体1分钟内呈红色为阳性；若试剂混匀后1分钟内颜色无变化，再加入0.1g锌粉混匀观察5分钟，颜色无变化者为强阳性，出现红色或淡红色者为真阴性；空白对照从无色变为红色。

如阳性对照或阴性对照无结果，空白对照未变为红色，本次实验结果为无效。

1.每次试验必须有阳性对照菌株结核分枝杆菌H ₃₇Rv和阴性对照菌株牛结核分枝杆菌。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

4.使用过的试管、磨菌管、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

5.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外线照射2小时，对分离培养实验室紫外线照射2小时消毒。

硝酸还原试验阳性结果判断为结核分枝杆菌，硝酸还原阴性结果可能为牛结核分枝杆菌和其他非结核分枝杆菌。

生长速度指在固体培养基上细菌形成成熟、肉眼可见菌落的时间，分枝杆菌菌群中不同菌种生长速度不同，一周内形成菌落的为快速生长分枝杆菌；反之则为缓慢生长分枝杆菌。

主要用于区分快速和缓慢生长分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温培养箱。

中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

无菌磨菌管/无菌带螺旋盖磨菌瓶，无菌玻璃珠；麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）；培养管；22SWG标准接种环；无菌吸管；无菌培养管；培养管架。

缓慢生长对照菌株:堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）ATCC 12478CMCC（B）95013；快速生长对照菌株:草分枝杆菌（ M. phlei） ATCC 111758CMCC（B）95024。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做PNB试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌管中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌管底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入无菌生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备缓慢生长对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和快速生长对照菌株草分枝杆菌（ M. phlei）的菌悬液。

2）在磨菌瓶上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入装玻璃珠的磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒；静置15分钟；在生物安全柜内小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，再静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液约1ml，转移到另一支无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊；逐步加无菌生理盐水直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备缓慢生长对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和快速生长对照菌株草分枝杆菌（ M. phlei）的菌悬液。

取无菌培养管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，使用移液器取0.5ml的1mg/ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的培养管中，终浓度到10 ^-1 mg/ml。

取2管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22 SWG标准接种环分别蘸取1环（即0.01ml）10 ^-1 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10 ^-3 mg/管。接种后的培养基置于培养架上，1只置于恒温培养箱28℃培养，另一只置于37℃培养。

同样接种快速和缓慢对照菌株培养。

于接种后3～7天观察，以后每周观察一次结果，直至孵育4周，同时记录中性改良罗氏培养基上菌落生长情况。在28℃和37℃培养一周左右可见菌落的为快速生长的非结核分枝杆菌；仅在37℃培养4周左右可见菌落的为结核分枝杆菌复合群，在28℃和37℃培养4周可见菌落的为缓慢生长的非分枝杆菌。

如快速对照不生长或缓慢生长对照菌株不生长，本次实验结果为无效。

1.每次试验必须有缓慢生长对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）和快速生长对照菌株草分枝杆菌（ M. phlei）。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

4.使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

5.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外照射2小时，对分离培养实验室紫外照射2小时消毒。

28℃和37℃培养7天内阳性为快速生长的非结核分枝杆菌；仅在37℃培养4周阳性为结核分枝杆菌复合群，在28℃和37℃培养4周均阳性为缓慢生长的非结核分枝杆菌。

根据色素的产生可以将分枝杆菌分为三组，光产色菌在暗条件下生长产生不含色素菌落，只有在暴露于光照条件下才产色；暗产色菌无论在暗及光照下均产生深黄至橘橙色素菌落（一些菌株持续暴露于光照条件下能提高色素产生）；非产色菌，无论在有光照还是暗的情况下都不产生颜色，或产生淡黄色、浅黄褐色、黄褐色色素，这些颜色在光照下颜色不会加深。

主要用于区分光产色、暗产色和不产色分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

二级生物安全柜、恒温培养箱。

中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

无菌磨菌管/无菌带螺旋盖磨菌瓶，无菌玻璃珠；麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）；培养管；22SWG标准接种环；无菌吸管；无菌培养管；培养管架。

光产色对照菌株:堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）ATCC 12478CMCC（B）95013；暗产色对照菌株:戈登分枝杆菌（ M. gordonae）ATCC 14470CMCC（B）95018；不光产色对照菌株:胞内分枝杆菌（ M. intracellulare）ATCC 13950CMCC（B）95002；颜色随温度变化菌株:苏加分枝杆菌（ M. szulgai）NTCT10831。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周）无需传代即可做试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌管上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌管中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌管底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入无菌生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备光产色对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）、暗产色对照菌株戈登分枝杆菌（ M. gordonae）、不光产色对照菌株胞内分枝杆菌（ M. intracellulare）、颜色随温度变化菌株苏加分枝杆菌（ M. szulgai）的菌悬液。

2）在磨菌瓶上标记好样品编号，于生物安全柜中使用无菌吸管吸取无菌生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用消毒过的接种环刮取2～3周的新鲜菌落，放入装玻璃珠的磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒；静置15分钟；在生物安全柜内小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，再静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀；用无菌吸管吸取中上部的菌液约1ml，转移到另一支无菌试管中，与标准麦氏比浊管比浊；逐步加无菌生理盐水直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即为1mg/ml的菌液。同样制备制备光产色对照菌株堪萨斯分枝杆菌（ M. kansasii）、暗产色对照菌株戈登分枝杆菌（ M. gordonae）、不光产色对照菌株胞内分枝杆菌（ M. intracellulare）、颜色随温度变化菌株苏加分枝杆菌（ M. szulgai）的菌悬液。

取无菌培养管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，待菌悬液静置片刻使菌液中的颗粒或菌块沉淀后。用移液器吸取0.5ml的1mg/ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的培养管中使终浓度到10 ^-1 mg/ml，。

取4管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期和稀释浓度，用22SWG标准接种环分别蘸取1环（即0.01ml）10 ^-1 mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10 ^-3 mg/管。接种后的2支培养基以锡纸或黑纸包裹密封，另2支不包。将两支培养基（1支包纸和1支不包纸）在37℃培养，另2支于28℃培养。不包纸的培养基长出菌落时，打开2支包纸的培养管观察:有色素产生为暗产色菌；无色素产生者或者有淡黄色、浅黄褐色、黄褐色色素，在生物安全柜内放松管盖进行通气，同时以100W钨灯近距离（灯至试管的距离≤50cm）照射3小时，放置于原温度孵育3天，每天观察。

同样接种培养四种对照菌株并观察。

在暗处有深黄至橘橙色素菌落产生为暗产色菌；无色素或产生经光照后，出现颜色或颜色加深者为光产色；无色素或者有淡黄色、浅黄褐色、黄褐色色素者经光照，产生颜色或颜色加深者为光产色菌；而经光照菌落颜色未改变者为不产色菌。

如阳性对照不生长或阴性对照生长，本次实验结果为无效。

1.每次试验必须有四种对照菌株。

2.所有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为2～3周且生长良好。

3.所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

4.所有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

1.无菌生理盐水可以使用无菌PBS缓冲液（pH=6.8）代替；可以在无菌生理盐水或PBS中加入终浓度0.5%的吐温-80以便于细菌分散。

2.从斜面刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

3.所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

4.使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

5.生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外线照射2小时，对分离培养实验室紫外线照射2小时消毒。

暗产色菌和光产色菌为非结核分枝杆菌；不产色菌可能为结核分枝杆菌复合群。